Традиционалните дијагностички стратегии за откривање на заразни болести бараат употреба на инструменти на клупата кои не се погодни за тестирање во точка на грижа (POCT).Новите микрофлуидици се многу минијатуризирана, автоматизирана и интегрирана технологија која е потенцијална алтернатива на традиционалните методи за брза, евтина и точна дијагностика на лице место.Молекуларните дијагностички методи се широко користени во микрофлуидните уреди како најефективни методи за откривање на патогени.Овој преглед ги сумира неодамнешните достигнувања во молекуларната дијагностика на заразни болести базирана на микрофлуиди и од академска и од индустриска перспектива.Прво, опишуваме типична обработка на нуклеинските киселини на чип, вклучувајќи предтретман на примерокот, засилување и читање на сигналот.Потоа се споредуваат карактеристиките, предностите и недостатоците на четирите типа на микрофлуидни платформи.Следно, ќе разговараме за употребата на дигитални анализи за апсолутна квантификација на нуклеинските киселини.И класичните и неодамнешните комерцијални молекуларни дијагностички уреди базирани на микрофлуиди се сумирани како доказ за моменталната состојба на пазарот.Конечно, предлагаме идни насоки за микрофлуидна дијагноза на заразни болести.
Заразните болести се предизвикани од патогени, вклучувајќи бактерии, вируси и паразити, кои се дистрибуирани низ целиот свет.За разлика од другите болести, патогените брзо се инфицираат и се шират помеѓу луѓето и животните домаќини преку инокулација, воздух и вода [1].Превенцијата на заразни болести е критична како мерка за јавно здравје.Три главни стратегии за борба против заразните болести: (1) контрола на изворот на инфекција;(2) прекин на преносната патека;(3) заштита на чувствителните популации.Меѓу главните стратегии, контролата на изворот на инфекција се смета за најважна стратегија поради неговата практичност и ниска цена.Брзата дијагноза, изолација и третман на заразените индивидуи се критични и бараат брзи, чувствителни и точни дијагностички стратегии [2].Тековната дијагноза на заразни болести обично комбинира клинички преглед врз основа на знаци и симптоми и лабораториски студии како што се клеточна култура и молекуларна дијагностика, кои бараат обучен персонал, трудоинтензивни процедури и скапа опрема за тестирање [3, 4].Спречувањето на појава на заразни болести бара брза, ефтина и точна локална дијагноза, особено во области со ограничени ресурси каде што заразните болести се чести и тешки [5], како и третман во дивината или на бојното поле, каде што итни случаи се непредвидливи..медицинската нега е ограничена [6].Во овој контекст, микрофлуидиката е технологија која ги комбинира технологиите на микроелектромеханичките системи, нанотехнологијата или науката за материјали за прецизна манипулација со течности [7,8,9,10], обезбедувајќи нови можности за откривање на точка на грижа (POCT).) инфективни агенси надвор од болниците и лабораториите.Во споредба со традиционалната дијагностика која одзема многу време, микрофлуидната технологија нуди заштеда на примероци и трошоци за молекуларна дијагностика за време на појава на болести.Глобалното ширење на коронавирусна болест 2019 година (COVID-19) е предизвикано од тежок акутен респираторен синдром коронавирус 2 (SARS-CoV-2), така што важноста на микрофлуидиката за навремена превенција и контрола на пандемијата повторно е нагласена [11, 12 , 13].За разлика од традиционалната дијагностика, микрофлуидниот POCT користи мали преносливи уреди кои се движат од анализатори на клупа до мали тест ленти од страничниот тек за тестирање во близина на точката за земање примероци [14].Овие тестови се карактеризираат со поедноставена или без подготовка на примерок, брзо засилување на сигналот и чувствителни отчитувања на сигналот што резултира со кратко траење и точни резултати за неколку минути.Достапноста и масовното производство на инструменти за здравствена заштита базирани на микрофлуиди ги проширија нивните економични и директни дијагностички апликации надвор од болницата, во близина на пациентот, па дури и дома.
Меѓу постоечките стратегии за дијагностицирање на заразни болести, молекуларната дијагностика е една од најчувствителните [15, 16].Дополнително, молекуларната дијагностика често се користи како златен стандард за континуирано откривање на СОВИД-19, овозможувајќи директно откривање на вирусно специфични региони на РНК или ДНК пред почетокот на имунолошкиот одговор [17, 18].Во тековниот преглед, ги презентираме најновите достигнувања во молекуларните дијагностички процеси засновани на микрофлуиди за заразни болести, од академска перспектива до идни индустриски перспективи (сл. 1).Ќе започнеме со три клучни чекори во откривањето на нуклеинската киселина: предтретман на примерокот на чипот, засилување на нуклеинската киселина и читање сигнал.Потоа споредивме различни типови на микрофлуидни платформи со нивната структура и функција, покажувајќи уникатни карактеристики (јаки и слаби страни).Дигиталната детекција на нуклеинска киселина дополнително се дискутира и е дадена како пример на технологија од трета генерација за апсолутна квантификација на молекули на заразни патогени.Дополнително, ќе бидат претставени неколку типични и најнови комерцијални POCT уреди за да се демонстрира моменталната состојба на пазарот на микрофлуидни POCT за молекуларна дијагностика.Исто така, ќе разговараме и ќе ја објасниме нашата визија за идните апликации.
Модулите на микрофлуидни чипови за откривање на нуклеинска киселина можат да се поделат во три категории (земање примероци, препознавање и сигнализација) според нивните функции [19].Меѓу овие модули, модулот за земање примероци главно реализира лиза на примерокот и екстракција на нуклеинска киселина.Сензорскиот модул главно ја контролира конверзијата и засилувањето на сигналите на нуклеинската киселина.Модулот за сигнализација го детектира сигналот конвертиран и обработен од модулот за сензори.Врз основа на процесот на откривање нуклеински киселини на чип, ќе ги сумираме различните чипови кои можат да ја реализираат функцијата „влез и излез“.
Првиот чекор во откривањето на нуклеинската киселина е екстракција на нуклеинска киселина, односно изолирање на целната нуклеинска киселина од оригиналниот примерок.Екстракцијата на нуклеинска киселина се изведува за да се прочистат нуклеинските киселини од други молекуларни загадувачи, да се обезбеди интегритет на примарната структура на молекулите на нуклеинската киселина и да се оптимизираат резултатите.Екстракцијата на нуклеинска киселина бара неопходна лиза на примерокот и апсење на нуклеинска киселина, чиј квалитет и ефикасност имаат огромно влијание врз резултатите од истражувањето и дијагностиката.Сите суптилни несакани ефекти за време на екстракцијата може да го ограничат понатамошното откривање.На пример, методите на полимеразна верижна реакција (PCR) и изотермално засилување на јамката (LAMP) се инхибирани од некои резидуални органски растворувачи како што се етанол и изопропанол во реагенси за изолација на нуклеинска киселина [20].Екстракцијата од течна течност и екстракцијата во цврста фаза се најпопуларните методи за изолирање на нуклеинските киселини [21], меѓутоа, екстракцијата течност-течна на чип е крајно ограничена, бидејќи реагенсите што се користат во екстракцијата течност-течна предизвикуваат корозија на повеќето микрофлуидни чипови. .Овде ги истакнуваме методите за екстракција на цврста фаза базирани на микросреди и ги споредуваме нивните предности и недостатоци.
Силиконот е супстрат материјал компатибилен со нуклеинските киселини поради неговата биокомпатибилност, стабилност и леснотија на модификација [22].Поважно е, кога е модифициран со силика или други материјали, овој композит покажува својства за адсорпција на негативно наелектризираните нуклеински киселини при ниска pH вредност и услови на висока сол, додека се елуира со раствори со висока pH и ниска сол.Врз основа на овој феномен, можно е да се прочисти нуклеинската киселина.
Различни форми на материјали базирани на силициум диоксид се користени за екстракција на нуклеинска киселина во микрофлуиди, како што се силика мониста, прашоци, филтри за микрофибер и силика мембрани [23, 24, 25, 26].Во зависност од својствата на материјалот, материјалите базирани на силициум може да се користат во микроциркулите на различни начини.На пример, силициумските гранули, прашоци и комерцијални нанофилтри може едноставно да се стават во порите или микроканалите на микрофлуидните чипови и да помогнат во извлекувањето на нуклеинските киселини од примероците [27, 28, 29].Површински модифицирани силика мембрани може да се користат и за брзо прочистување на ДНК од патогени по ниска цена.На пример, Ванг и сор.[30] Со комбинирање на денатурираните реакции на засилување со размена на синџири посредувана од везикули со силика мембрани обложени со олигосахариди на хитозан, беше воведен разновиден пренослив систем кој успешно откри 102-108 единици кои формираат колонии.(CFU)/ml Vibrio parahaemolyticus., а присуството на вирусот беше лесно видливо.Пауел и сор.[31] Потоа се користеа микронизи базирани на силикон за откривање на вирусот на хепатитис Ц (ХЦВ), вирусот на хумана имунодефициенција (ХИВ), вирусот Зика и хуманиот папиломавирус и автоматско размножување, во кое беше развиен 1,3 μl извртен микрореактор за фаќање на РНК вируси.и да изврши на самото засилување.Покрај овие методи, површински модифицираните силициумски микроколумни исто така играат клучна улога во екстракцијата на нуклеинската киселина, бидејќи геометријата и својствата на материјалот за модификација значително ја зголемуваат ефикасноста на екстракцијата.Чен и сор.[32] предложи микрофлуидна платформа за изолација на РНК со ниска концентрација врз основа на амино-обложени силициумски микроколумни.Овој микрофлуиден уред интегрира низа од микростолбови од 0,25 cm2 на силициумска подлога за да постигне поголема ефикасност на екстракција преку дизајн со висок однос на површината и волуменот.Предноста на овој дизајн е што микрофлуидниот уред може да постигне до 95% ефикасност на екстракција на нуклеинска киселина.Овие стратегии базирани на силикон ја покажуваат вредноста на брзо изолирање на нуклеинските киселини по ниска цена.Во комбинација со микрофлуидни чипови, стратегиите за екстракција базирани на силикон не само што можат да ја зголемат ефикасноста на откривањето на нуклеинската киселина, туку и да ја олеснат минијатуризацијата и интеграцијата на аналитичките уреди [20].
Методите на магнетно раздвојување користат магнетни честички за да се изолираат нуклеинските киселини во присуство на надворешно магнетно поле.Најчесто користените магнетни честички вклучуваат Fe3O4 или γ-Fe2O3 магнетни честички обложени со силика, амино и карбоксил [33,34,35,36].Карактеристична карактеристика на магнетните честички во споредба со методите SPE базирани на силикон е леснотијата на манипулација и контрола со надворешни магнети.
Користејќи ја електростатската интеракција помеѓу нуклеинските киселини и силициум диоксид, во услови на висока сол и ниска pH вредност, нуклеинските киселини се адсорбираат на површината на магнетните честички обложени со силика, додека во услови на ниска сол и висока pH вредност, молекулите може да се измијат. повторно..Магнетни зрнца обложени со силика овозможуваат екстракција на ДНК од примероци со голем волумен (400 μL) со помош на магнетно контролирано движење [37].Како демонстрација, Родригез-Матеос и сор.[38] користел прилагодливи магнети за да го контролира преносот на магнетни зрнца во различни комори.Врз основа на магнетни честички обложени со силика, 470 копии/mL геномска РНК на SARS-CoV-2 може да се извлечат од примероците на отпадна вода за откривање на обратна транскрипција LAMP (RT-LAMP) и одговорот може да се прочита во рок од 1 час.голо око (сл. 2а).
Уреди базирани на магнетни и порозни материјали.Концептуален дијаграм на микрофлуидниот уред IFAST RT-LAMP за детекција на РНК SARS-CoV-2 (адаптирано од [38]).б Центрифугален микро уред за dSPE на букален брис нуклеинска киселина (адаптирано од [39]).c Вграден самонапојувачки концентратор на примероци со помош на FTA® картичка (прилагодено од [50]).d Fusion 5 филтер-хартија модифицирана со хитосан (адаптирано од [51]).SARS-CoV-2 тежок акутен респираторен синдром коронавирус 2, RT-LAMP изотермално засилување со посредство на јамка за обратна транскрипција, технолошки партнери за пронаоѓачи на FTA, NA нуклеинска киселина
Позитивно наелектризираните магнетни честички се идеални за прицврстување на фосфатниот столб на нуклеинската киселина.При одредена концентрација на сол, негативно наелектризираните фосфатни групи на нуклеински киселини можат да бидат позитивно наелектризирани на површината на магнетните композитни честички.Затоа, за екстракција на нуклеински киселини беа развиени магнетни наночестички со груба површина и висока густина на амино групи.По магнетното одвојување и блокирање, магнетните наночестички и ДНК комплексите можат директно да се користат во PCR, што ја елиминира потребата за сложени и долготрајни операции за прочистување и елуција [35].Магнетни наночестички обложени со негативни карбоксилни групи исто така се користени за одвојување на нуклеинските киселини адсорбирани на површини во раствори на полиетилен гликол и натриум хлорид со висока концентрација [36].Со овие површински модифицирани магнетни зрна, екстракцијата на ДНК е компатибилна со последователно засилување.Дигнан и сор.[39] опиша автоматизирана и пренослива центрифугална микрофлуидна платформа за предтретман со нуклеинска киселина, дозволувајќи им на нетехничкиот персонал да ја користи на лице место.Дополнително, компатибилноста на изолираната ДНК со LAMP, метод добро прилагоден за анализа на нуклеинска киселина во точка на грижа, дополнително покажува минимални барања за опрема и соодветност за колориметриски анализи (сл. 2б).
Методите на магнетни зрнца нудат можност за автоматско екстракција, од кои некои постојат во комерцијални автоматизирани екстрактори на нуклеинска киселина [KingFisher;ThermoFisher (Волтам, МА, САД), QIAcube® HT;CapitalBio (Пекинг, Кина) и Biomek®;Бекман (Мајами, САД).), Флорида, САД)].Предностите од комбинирање на магнетни зрна со микрофлуиди може да се искористат за ефикасно автоматизирано екстракција на нуклеинските киселини, што потенцијално би можело да го унапреди развојот на молекуларната дијагностика;сепак, комбинацијата на магнетни зрна со микрофлуидика сè уште во голема мера се потпира на комплексни контролни системи за прецизна манипулација со магнетни зрна, што ја објаснува популарноста на комерцијалните производи да бидат обемни и скапи, што ја ограничува понатамошната примена на магнетни зрна во POCT.
Неколку порозни материјали како што се модифицирани нитроцелулозни филтри, картички Finders Technology Associates (FTA), филтер-хартии базирани на полиетерсулфон и материјали обложени со гликан исто така се користени за откривање на нуклеинска киселина [40, 41, 42, 43, 44].Порозните влакнести материјали, како што е фиброзната хартија, за првпат биле користени за изолирање на ДНК со физичко заплеткување на долготрајните ДНК молекули со влакна.Малите пори доведуваат до силно физичко ограничување на молекулите на ДНК, што позитивно влијае на екстракцијата на ДНК.Поради различните големини на порите на фиброзната хартија, ефикасноста на екстракција не може да ги задоволи потребите за засилување на ДНК [45, 46].FTA картичката е комерцијална филтер-хартија која се користи во областа на судската медицина и широко се користи во други области на молекуларна дијагностика.Преку употреба на целулозна филтер-хартија импрегнирана со различни хемикалии за лизирање на клеточните мембрани во примерокот, ослободената ДНК е заштитена од разградување до 2 години.Во поново време, импрегнирана целулозна хартија е развиена за молекуларно откривање на различни патогени, вклучувајќи SARS-CoV-2, лајшманиоза и маларија [47,48,49].ХИВ во изолираната плазма директно се лизира, а вирусната нуклеинска киселина се збогатува во мембраната за проток на FTA® вградена во концентраторот, што овозможува ефикасно производство на нуклеинската киселина [50] (Сл. 2в).Главниот проблем со откривањето на нуклеинската киселина со користење на FTA картички е дека хемикалиите како што се гванидин и изопропанол ги инхибираат последователните реакции на засилување.За да го решиме овој проблем, развивме филтер-хартија модифицирана со хитозан Fusion 5, која ги комбинира предностите на физичкото преплетување на молекулите на ДНК и фиброзната филтер-хартија и електростатската адсорпција на ДНК на соединенијата модифицирани со хитозан за да се постигне високо ефикасно екстракција на нуклеинска киселина ..филтер влакна [51] (сл. 2г).Слично на тоа, Жу и сор.[52] покажа PCR метод модифициран со хитозан базиран на in situ капиларен микрофлуиден систем за брза изолација и детекција на РНК вирусот Зика.Нуклеинските киселини може да се адсорбираат/десорбираат во мешан лизат/ПЦР медиум, соодветно, врз основа на својството на прекинувачот за вклучување/исклучување на хитозанот.вклучување и исклучување“, реагира на pH вредност.
Како што споменавме погоре, овие стратегии ги комбинираат предностите на различните материјали од цврста фаза и ја зголемуваат ефикасноста на екстракцијата на нуклеинска киселина во микрофлуиди.Во практична примена, употребата на овие материјали во големи количини е неекономична, а соодветната површинска обработка или површинската модификација на вообичаените материјали со овие материјали исто така може да ја зачува нивната функција.Затоа, се верува дека имплементацијата на овие стратегии по пилот студија може да ги намали трошоците.
Тестирањето на нуклеинска киселина на микрофлуидни платформи често користи мали волумени на примероци (< 100 µl), затоа бара засилување на целните нуклеински киселини со специфични сонди за конверзија во сигнал кој е погоден за откривање низводно (оптички, електрични и магнетни) [53, 54]. Тестирањето на нуклеинска киселина на микрофлуидни платформи често користи мали волумени на примероци (< 100 µl), затоа бара засилување на целните нуклеински киселини со специфични сонди за конверзија во сигнал кој е погоден за откривање низводно (оптички, електрични и магнетни) [53, 54]. При тестировании нуклеиновых кислот на микрожидкостных платформах часто используются небольшие объемы образцов (< 100 мкл), поэтому требуется амплификация целевых нуклеиновых кислот с помощью специальных зондов для преобразования в сигнал, удобный для последующего обнаружения (оптического, электрического и магнитного) [53, 54]. При тестирање на нуклеинските киселини на микрофлуидни платформи, често се користат мали волумени на примероци (<100 µL), па затоа е потребно засилување на целните нуклеински киселини со специјални сонди за да се претвори во сигнал погоден за последователно откривање (оптички, електричен и магнетен). [53, 54].微流控平台上的核酸检测通常使用小样本量（< 100 µl），因此需要使用特定探针扩增目标核酸，以转换为便于下游检测（光学、电学和磁学）的信号[53, 54 ].微流控 平台 上 的 核酸 检测 使用 小样本量 （（<100 µl） ， 因此 需要 特定 探针 扩增 目标 ， 以 转换 为 下游 下游 （光学 、 电学 磁学） 的 信号 [53, 54, 54, 54 ]. Обнаружение нуклеиновых кислот на микрожидкостных платформах обычно использует небольшие объемы образцов (<100 мкл), что требует амплификации целевых нуклеиновых кислот с помощью специальных зондов для преобразования в сигналы для последующего обнаружения (оптического, электрического и магнитного) [53, 54]]. Откривањето на нуклеинските киселини на микрофлуидните платформи обично користи мали волумени на примероци (<100 μl), што бара засилување на целните нуклеински киселини со специјални сонди за да ги претворат во сигнали за последователно откривање (оптички, електрични и магнетни) [53, 54] .Засилувањето на нуклеинската киселина во микрофлуиди, исто така, може да ги забрза реакциите, да ги оптимизира границите за откривање, да ги намали барањата за примероци и да ја подобри точноста на откривање [55, 56].Во последниве години, со реализација на брзо и прецизно детектирање, во микрофлуидиката се применуваат различни методи за засилување на нуклеинските киселини, вклучително и PCR и некои изотермални реакции на засилување.Овој дел ќе ги сумира методите за откривање на нуклеинска киселина врз основа на микрофлуидни системи.
PCR е симулација на процесот на репликација на ДНК на еден организам, чија теорија е детално опишана на друго место и нема да се дискутира овде.PCR може да засили многу мала количина на целна ДНК/РНК со експоненцијална брзина, што ја прави PCR моќна алатка за брзо откривање на нуклеинските киселини.Во последниве децении, развиени се многу преносливи микрофлуидни уреди опремени со PCR системи за термички циклуси за да се задоволат потребите на дијагностика во точка на грижа [57, 58].PCR на чип може да се подели на четири типа (конвенционален, континуиран проток, просторно префрлен и конвективен PCR) според различни методи за контрола на температурата [59].На пример, Gee et al.[60] развија директна обратна транскрипција квантитативна PCR (RT-qPCR) метода на сопствената микрофлуидна платформа за мултиплекс откривање на вирусите САРС-КоВ-2, инфлуенца А и Б во примероците од брис од грло (сл. 3а) .Парк и сор.[61] изгради едноставен чип за анализа на патоген со интегрирање на тенок филм PCR, електроди и микрофлуиден модул базиран на полидиметилсилоксан на прсти.Сепак, и двете дела ги отелотворуваат заедничките недостатоци на конвенционалната PCR.PCR бара термички циклус, што ја ограничува понатамошната минијатуризација на уредот и намаленото време на тестирање.
Развојот на микрофлуидна ПЦР базирана на континуиран проток и префрлување на просторот е од клучно значење за да се реши ова прашање.Користејќи долг серпентински канал или краток правилен канал, PCR со континуиран проток може да обезбеди брзо засилување со активно циркулирање на реагенси во три зони за предзагревање со пумпа надвор од чипот.Оваа операција успешно ја избегнува преодната фаза помеѓу различните температури на реакцијата и на тој начин значително го намалува времето на тестирање [62] (сл. 3б).Во друга студија на Јунг и сор.[63] предложи нов ротационен PCR генетски анализатор кој ги комбинира карактеристиките на фиксна и проточна PCR за ултрабрза и мултиплексна обратна транскрипција PCR (сл. 3в).За засилување на нуклеинската киселина, PCR микрочипот ќе се ротира низ три грејни блока на различни температури: 1. блок за денатурација 94°C, 2. блок за жарење на 58°C, 3. блок за проширување на 72°C.
Примена на PCR во микрофлуидика.Шематски приказ на dirRT-qPCR на микрофлуидна платформа (адаптирано од [60]).б Шематски приказ на микрониза PCR со континуиран проток базирана на серпентин канал (адаптирано од [62]).в.г Дијаграм на термоконвекциона PCR со центрифугирање и поставување (прилагодено од [64]).DirRT-qPCR, директна квантитативна реверзна транскрипциона полимеразна верижна реакција
Користејќи капилари и јамки или дури и тенки плочи, конвекциониот PCR може брзо да ги засили нуклеинските киселини со природна слободна топлинска конвекција без потреба од надворешна пумпа.На пример, циклична олефинска полимерна микрофлуидна платформа беше развиена на фабрикувана ротирачка фаза за загревање која користи термички циклус со центрифугирање во микроканал на PCR јамка [64] (сл. 3г).Реакциониот раствор се движи со топлинска конвекција, која континуирано разменува висока и ниска температура во микроканал со прстенест структура.Целиот процес на засилување може да се заврши за 10 минути со ограничување за откривање од 70,5 pg/канал.
Како што се очекуваше, брзата PCR е моќна алатка за целосно интегрирани молекуларни дијагностички системи и системи за мултиплексна анализа со одговор на примерок.Брзата ПЦР значително го намалува времето потребно за откривање на САРС-КоВ-2, што придонесува за ефикасна контрола на пандемијата COVID-19.
PCR бара комплексен термички циклус кој не е погоден за POCT.Во поново време, техниките за изотермално засилување се применети на микрофлуидиката, вклучувајќи, но не ограничувајќи се на LAMP, засилување на рекомбиназна полимераза (RPA) и засилување врз основа на секвенци на нуклеинска киселина [65,66,67,68].Со овие техники, нуклеинските киселини се засилуваат на константна температура, што го олеснува создавањето на евтини, високо чувствителни преносливи POCT уреди за молекуларна дијагностика.
Тестовите на LAMP базирани на микрофлуиди со висок пропуст овозможуваат повеќекратно откривање на заразни болести [42, 69, 70, 71].Во комбинација со центрифугален микрофлуиден систем, LAMP може дополнително да ја олесни автоматизацијата на откривањето на нуклеинската киселина [69, 72, 73, 74, 75].Spin-and-react SlipChip беше развиен за визуелно откривање на повеќе паралелни бактерии користејќи LAMP [76] (сл. 4а).При користење на оптимизирана LAMP во анализата, односот сигнал на флуоресценција-шум беше приближно 5 пати, а границата за откривање достигна 7,2 копии/μl геномска ДНК. Покрај тоа, постоењето на пет вообичаени дигестивни бактериски патогени, вклучувајќи Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis и Vibrio parahaemolyticus, беа визуелизирани врз основа на методот за <60 мин. Покрај тоа, постоењето на пет вообичаени дигестивни бактериски патогени, вклучувајќи Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis и Vibrio parahaemolyticus, беа визуелизирани врз основа на методот за <60 мин.Покрај тоа, присуството на пет вообичаени бактериски патогени на дигестивниот тракт, вклучувајќи Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis и Vibrio parahaemolyticus, беше визуелизирано со користење на овој метод за помалку од 60 минути.此外 ， 基于 该 方法 在 <60 分钟 内 可 视化 了 种 常见 消化道 细菌病 原体 存在 存在 ， 蜡状 芽孢杆菌 、 大 肠杆菌 肠 沙门 氏 菌 、 弧菌 副溶血性 副溶血性。。此外 ， 基于 该 方法 在 <60 分钟 内 视化 了 五 种 常见 消化道 的 存在 ， 包括 芽孢杆菌 、 肠杆菌 、 肠 氏 菌 、 弧菌 和 性 。。。 弧菌 弧菌 弧菌弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 HIPДополнително, присуството на пет вообичаени бактериски гастроинтестинални патогени, вклучувајќи Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvius и Vibrio parahaemolyticus, беше визуелизирано со користење на овој метод за помалку од 60 минути.
Предностите на LAMP во микрофлуидиката вклучуваат, меѓу другото, брз одговор и минијатуризирано откривање.Сепак, поради температурата на реакцијата (околу 70°C), аеросолите неизбежно се генерираат за време на LAMP, што резултира со висока стапка на лажно позитивна стапка.Специфичноста на анализата, дизајнот на прајмерот и контролата на температурата исто така треба да се оптимизираат за LAMP.Дополнително, дизајните на чипови кои имплементираат повеќекратно откривање цел на еден чип се од голема вредност и треба да се развијат.Покрај тоа, LAMP е погодна за повеќенаменско откривање интегрирано во еден чип, што е од големо значење, но има уште многу простор за развој.
Високата лажно позитивна стапка на LAMP може делумно да се намали со RPA, бидејќи релативно ниската температура на реакцијата (~37 °C) резултира со релативно малку проблеми со испарувањето [77].Во системот RPA, два спротивни прајмери иницираат синтеза на ДНК со врзување за рекомбиназа и засилувањето може да се заврши во рок од 10 минути [78,79,80,81].Затоа, целиот процес на RPA е многу побрз од PCR или LAMP.Во последниве години, микрофлуидната технологија се покажа дека дополнително ја подобрува брзината и точноста на RPA [82,83,84].На пример, Лиу и сор.[85] разви микрофлуидна интегрирана анализа за засилување на полимеразата рекомбиназа на латерален проток за брзо и чувствително откривање на SARS-CoV-2 со интегрирање на RPA со обратна транскрипција (RT-RPA) и универзален систем за откривање на тест ленти за латерален проток.во единствен микрофлуиден систем.Слика 4б).Границата на откривање е 1 копија/µl или 30 копии/примерок, а откривањето може да се заврши за околу 30 минути.Конг и сор.развија микрофлуиден уред што може да се носи.[86] користеше телесна температура и систем за откривање на флуоресценција базиран на мобилен телефон за брзо и директно откривање на ДНК на ХИВ-1 користејќи RPA (Слика 4в).Анализата RPA што може да се носи открива 100 копии/mL од целната секвенца во рок од 24 минути, покажувајќи голем потенцијал за брза дијагноза на доенчиња инфицирани со ХИВ-1 во услови со ограничени ресурси.
Изотермално засилување при тестирање во точка на нега (POCT).Развој и производство на спин и реакција SlipChip.По заварувањето со плазма, горните и долните чипови беа собрани со збир на навртки за да се формира конечниот чип (прилагодено од [76]).б Шема на системот MI-IF-RPA за откривање COVID-19 (прилагодено од [85]).в Шема на нослив RPA тест за брзо откривање на ХИВ-1 ДНК (адаптирано од [86]).SE Salmonella enterica, VF Vibrio fluvius, VP Vibrio parahaemolyticus, BC Bacillus cereus, EC Escherichia coli, FAM карбоксифлуоресцеин, вирусот на хумана имунодефициенција ХИВ, RPA рекомбиназа полимераза засилување, LED диода што емитува светлина, MI-IFFluid-R Integrated Засилување
RPA базирана на микрофлуиди брзо се развива, меѓутоа, трошоците за производство на чипови и потрошувачката на реакција се превисоки и мора да се намалат за да се зголеми достапноста на оваа технологија.Покрај тоа, високата чувствителност на RPA може да влијае на засилување на неспецифични производи, особено во присуство на контаминација.Овие ограничувања може да влијаат на примената на RPA во микрофлуидните системи и заслужуваат понатамошна оптимизација.Исто така, потребни се добро дизајнирани прајмери и сонди за различни цели за да се подобри изводливоста на микрофлуидните стратегии засновани на RPA во POCT.
Cas13 и Cas12a имаат способност случајно да ги расцепуваат нуклеинските киселини и на тој начин можат да се развијат како алатки за откривање и дијагностика.Cas13 и Cas12a се активираат при врзување за целната ДНК или РНК, соодветно.Откако ќе се активира, протеинот почнува да ги расцепува другите блиски нуклеински киселини, по што водечките РНК кои ги таргетираат нуклеинските киселини специфични за патогенот може да ги расцепат изгасените флуоресцентни сонди и да ослободат флуоресценција.Врз основа на оваа теорија, Келнер и сор.[87] разви метод заснован на Cas13 [Специфично отклучување на ензимски известувач со висока чувствителност (ШЕРЛОК)] и Бротон и сор.[88] разви друг пристап базиран на Cas12a [CRISPR Trans Reporter таргетирање на ДНК ендонуклеаза (DTECR)].
Во последниве години, се појавија различни методи за откривање на нуклеински киселини базирани на CRISPR [89, 90].Конвенционалните методи базирани на CRISPR често одземаат многу време и се трудоинтензивни поради повеќе процедури, вклучувајќи екстракција на нуклеинска киселина, засилување и откривање CRISPR.Изложеноста на течности на воздух може да ја зголеми можноста за лажно позитивни резултати.Со оглед на горенаведеното, системите базирани на CRISPR имаат очајна потреба од оптимизација.
Пневматски контролирана микрофлуидна платформа која може да врши 24 анализи паралелно е развиена за апликациите за откривање CRISPR-Cas12a и CRISPR-Cas13a [91].Системот е опремен со уред за детекција на флуоресценција кој го заобиколува засилувањето на нуклеинската киселина и автоматски ги открива примероците од фемтомоларната ДНК и РНК.Чен и сор.[92] интегрирано засилување на рекомбиназа со системот CRISPR-Cas12a во центрифугална микрофлуидика (сл. 5а).Оваа работа ја надминува тешкотијата за интегрирање на овие два процеса бидејќи Cas12a може да ја вари ДНК-местенката и да го инхибира процесот на засилување.Покрај тоа, Чен и сор.[92] дополнително ги складирал реагенсите за реакција во центрифугална микрофлуидна контрола за автоматски да го заврши целиот процес.Во друго дело, Силва и сор.[93] разви дијагностички метод без засилување CRISPR/Cas12a и паметен телефон за откривање на САРС-КоВ-2 (сл. 5б).Оваа анализа, позната како систем без засилување базиран на мобилен телефон, вклучува ензим зависен од CRISPR/Cas кој се базира на визуелизација на паметни телефони на сигнали од меурчиња генерирани од каталаза во микрофлуидни канали.Чувствително откривање на помалку од 50 копии/µl нуклеинска киселина без претходно засилување, целиот процес од инјектирање на примерокот до читање на сигналот трае само 71 минута.
Методи за откривање на нуклеинска киселина базирани на CRISPR.Центрифугална POCT за интегрирана молекуларна дијагностика базирана на CRISPR (адаптирано од [92]).б Развој на тест CASCADE за анализа базирана на паметни телефони на SARS-CoV-2 (адаптирано од [93]).RAA рекомбиназа засилување, PAM соседен мотив на протоспејсер, CRISPR групирани кратки палиндромски повторувања во редовни интервали, CASCADE систем без засилување на мобилен телефон со ензими зависни од CRISPR/CAS, 1-етил-3-[3-диметиламинопропил]карбодиимид EDC хидрохлорид
Како последен чекор во откривањето на нуклеинската киселина, откривањето на сигналот директно ги рефлектира дијагностичките резултати и е критичен фактор во развојот на ефикасен, чувствителен и точен POCT.Сигналите може да се читаат со користење на различни методи како што се флуоресцентни, електрохемиски, колориметриски и магнетни стратегии.Во овој дел, го опишуваме образложението за секој пристап и ја споредуваме молекуларната дијагностика на заразни болести во микрофлуидиката.
Стратегиите засновани на флуоресценција се широко користени за POCT дијагностика на заразни болести поради нивните извонредни предности на одлична чувствителност, ниска цена, леснотија на работење и анализа на точката на грижа [94, 95].Овие стратегии користат означени флуорофори, како што се флуоресцентни бои и наноматеријали за да создадат сигнал што може да се открие (зајакнување или гаснење на флуоресценцијата).Ова откритие сугерира дека стратегиите засновани на флуоресценција може да се поделат на директно флуоресцентно означување, сигнализирање и сигнално исклучување флуоресцентно детекција [96].Директното откривање на флуоресцентни ознаки користи специјални флуоресцентни ознаки за означување на специфични лиганди кои генерираат одредена количина на флуоресценција кога селективно се врзуваат за целта.За детекција на флуоресценција базирана на сигнал, квалитетот на флуоресцентниот сигнал е позитивно поврзан со големината на интерес.Интензитетот на флуоресценцијата е занемарлив во отсуство на цел и е забележлив кога е присутна доволна количина на цел.Спротивно на тоа, интензитетот на флуоресценцијата откриен со флуоресценцијата „исклучен сигнал“ е обратно пропорционален на количината на целта, првично достигнувајќи максимална вредност и постепено се намалува како што целта се зголемува.На пример, користејќи го CRISPR-Cas13a механизмот за транс-расцепување зависен од целта, Tian et al.[97] разви нова стратегија за препознавање за откривање на РНК кои директно ја заобиколуваат обратната транскрипција (сл. 6а).По врзувањето за комплементарни целни РНК, комплексот CRISPR-Cas13-РНК може да се активира, предизвикувајќи трансколатерално расцепување од неспецифични известувачки РНК.Флуоресцентно означениот репортер [флуорофор (F)] се гаси со гаснечот (Q) недопрен и флуоресцира кога се расцепува од активираниот комплекс.
Предноста на електрохемиското откривање е голема брзина на откривање, лесно производство, ниска цена, лесна за носење и автоматска контрола.Тоа е моќен аналитички метод за POCT апликации.Врз основа на графен транзистори со ефект на поле Gao et al.[98] разви нанобиосензор за мултиплекс откривање на антигени на Лајмската болест од бактеријата Borrelia burgdorferi со граница на детекција од 2 pg/mL (сл. 6б).
Колориметриските анализи се користени во апликациите на POCT, кои имаат корист од предностите на преносливост, ниска цена, леснотија на подготовка и визуелно читање.Колориметриското детекција може да користи оксидација на пероксидаза или наноматеријали слични на пероксидаза, агрегација на наноматеријали и додавање на индикаторски бои за да ги конвертира информациите за присуството на целните нуклеински киселини во видливи промени на бојата [99, 100, 101].Имено, златните наночестички се широко користени во развојот на колориметриски стратегии, а поради нивната способност да индуцираат брзи и значајни промени на бојата, постои зголемен интерес за развој на POCT колориметриски платформи за in situ дијагноза на заразни болести [102].Со интегриран центрифугален микрофлуиден уред [103], патогените од храната во контаминираните примероци на млеко може автоматски да се детектираат на ниво на 10 бактериски клетки, а резултатите може визуелно да се прочитаат во рок од 65 минути (сл. 6в).
Техниките за магнетни сензори можат прецизно да детектираат аналити користејќи магнетни материјали, а во последните децении има значителен интерес за POCT апликациите.Техниките за магнетно сензор имаат некои уникатни предности како што се евтините магнетни материјали наместо скапите оптички компоненти.Сепак, употребата на магнетно поле ја подобрува ефикасноста на откривање и го намалува времето за подготовка на примерокот [104].Дополнително, резултатите од магнетното сондирање покажуваат висока специфичност, чувствителност и висок сооднос сигнал-шум поради незначителниот сигнал за магнетна позадина на биолошките примероци [105].Шарма и сор.интегриран биосензор базиран на магнетна тунелна спојка во пренослива платформа за микрочип.[106] за мултиплекс откривање на патогени (сл. 6г).Биосензорите чувствително откриваат субнаномоларни нуклеински киселини изолирани од патогени.
Типичен метод за откривање сигнал.Концептот на хиперлокализирано откривање на Cas13a (прилагодено од [97]).б Графенски нанобиосензор FET во комбинација со Lyme GroES scFv (адаптирано од [98]).c Колориметриски индикации за мултиплекс откривање на патогени преку храна во центрифугален микрофлуиден чип: примероци бр. 1 и бр. 3 со целни патогени и бр. 2, бр. 4 и бр. 5 примероци без целни патогени (адаптирано од [103]) .г Биосензор базиран на магнетна тунелна спојка, вклучувајќи платформа, вграден блокирачки засилувач, контролна единица и напојување за генерирање/добивање сигнал (адаптирано од [106]).GFET Графен FET, Escherichia coli, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio parahaemolyticus, Listeria monocytogenes, PC PC, PDMS диметикон, PMMA полиметил метакрилат
И покрај одличните карактеристики на горенаведените методи за откривање, тие сè уште имаат недостатоци.Овие методи се споредуваат (табела 1), вклучувајќи и некои апликации со детали (добрите и лошите страни).
Со развојот на микрофлуидиката, микроелектромеханичките системи, нанотехнологијата и науката за материјали, употребата на микрофлуидни чипови за откривање на заразни болести постојано напредува [55,96,107,108].Прецизната манипулација со минијатурна опрема и течности придонесува за дијагностичка точност и исплатливост.Затоа, за понатамошен развој, направени се напори за оптимизирање и надградба на чиповите, што резултира со различни микрофлуидни чипови со различни структури и функции.Овде накратко воведуваме неколку вообичаени типови на микрофлуидни платформи и ги споредуваме нивните карактеристики (добрите и лошите страни).Покрај тоа, повеќето од примерите наведени подолу се фокусираат првенствено на борбата против САРС-КоВ-2.
LOCC се најчестите минијатуризирани комплексни аналитички системи и нивните операции се високо минијатуризирани, интегрирани, автоматизирани и паралелизирани од инјектирање и подготовка на примерокот, контрола на проток и детекција на течност [109, 110].Течностите се манипулираат преку внимателно дизајнирана геометрија и интеракцијата на многу физички ефекти како што се градиенти на притисок, капиларно дејство, електродинамика, магнетни полиња и акустични бранови [111].LOCC покажува одлични предности во високопропусна проверка и повеќекратно откривање, со брза брзина на анализа, мала големина на примерокот, мала потрошувачка на енергија и висока ефикасност на управување и работа;сепак, LOCC уредите се многу деликатни и се изработуваат, пакуваат и се поврзуваат.Сепак, мултиплексирањето и повторната употреба се соочуваат со огромни тешкотии [96].Во споредба со другите платформи, LOCC има единствени предности во однос на максималната разновидност на апликациите и најдобрата технолошка компатибилност, но неговите недостатоци се исто така очигледни, имено високата сложеност и слабата повторливост.Зависноста од надворешни пумпи, кои често се гломазни и скапи, дополнително ја ограничува нивната употреба во POCT.
За време на избувнувањето на СОВИД-19, LOCC доби големо внимание.Во исто време, постојат неколку нови чипови кои комбинираат неколку технологии.На пример, паметните телефони сега се широко користени како преносни уреди за анализа и имаат голем потенцијал за интеграција на LOCC.Sun et al.[21] фабрикуваше микрофлуиден чип што овозможува мултиплексирање на специфични секвенци на нуклеинска киселина од пет патогени, вклучително и SARS-CoV-2, користејќи LAMP и ги анализираше со помош на паметен телефон во рок од 1 час по завршувањето на реакцијата.Како друг пример, Сундах и сор.[112] создаде молекуларен прекинувач [каталитичко засилување со прекинувач за молекуларна транзициона состојба (CATCH)] за директно и чувствително откривање на цели РНК SARS-CoV-2 со помош на паметни телефони. CATCH е компатибилен со пренослив LOCC и постигнува супериорни перформанси (приближно 8 копии на РНК/μl; < 1 час на собна температура) [112]. CATCH е компатибилен со пренослив LOCC и постигнува супериорни перформанси (приближно 8 копии на РНК/μl; < 1 час на собна температура) [112]. CATCH совместим со портативным LOCC и обеспечива превосходную производительность (на пример 8 копий РНК/мкл; < 1 ч при комнатной температура) [112]. CATCH е компатибилен со пренослив LOCC и обезбедува одлична пропусност (приближно 8 копии на РНК/µl; < 1 час на собна температура) [112]. CATCH 与便携式LOCC 兼容并具有卓越的性能（大约8 РНК 拷贝/μl；室温下< 1 小时]〧[112） CATCH 与便携式LOCC 兼容并具有卓越的性能（大约8 РНК 拷贝/μl；室温下< 1 小时]〧[112） CATCH совместим со портативными LOCC и обладает превосходной производительностью (на пример 8 копий РНК/мкл; < 1 часа при комнатной температура) [112]. CATCH е компатибилен со преносни LOCC и има одлични перформанси (приближно 8 копии на РНК/µl; < 1 час на собна температура) [112].Дополнително, уредите LOCC за молекуларна дијагностика користат и некои движечки сили како вакуум, истегнување и електрични полиња.Канг и сор.[113] покажа во реално време, ултра брз наноплазма-на-чип PCR за брза и квантитативна дијагноза на СОВИД-19 на терен користејќи вакуум плазмоничен течен PCR чип.Ли и сор.[114] последователно разви микрофлуиден чип управуван со истегнување кој овозможи дијагностицирање на СОВИД-19.Платформата го користи системот за засилување RT-LAMP за да утврди дали примерокот е квалитативно позитивен или негативен.Последователно, Рамачандран и сор.[115] постигна соодветни градиенти на електричното поле користејќи изотахофореза (ITP), техника на селективно фокусирање на јони имплементирана во микрофлуидиката.Со ITP, целната РНК од сурови примероци од назофарингеален брис може автоматски да се прочистува.Потоа Рамачандран и сор.[115] Комбинирајќи го ова прочистување на ITP со LAMP и CRISPR анализите засилени со ITP, открија SARS-CoV-2 кај човечки назофарингеален брис и клинички примероци за околу 35 минути.Покрај тоа, постојано се појавуваат нови идеи.Јадхав и сор.[116] предложи дијагностичка шема базирана на површинска подобрена Раман спектроскопија во комбинација со микрофлуиден уред кој содржи или вертикално ориентирани јаглеродни наноцевки обложени со злато/сребро или микро/наноцевки за еднократна употреба.Вградените микроканали на филтер функционализирани со мембрана се за еднократна употреба.Уредот адсорбира вируси од различни телесни течности/ексудации како што се плунка, назофаринкс и солзи.Така, титарот на вирусот е изобилен и вирусот може точно да се идентификува со потписот Раман.
LOAD е центрифугална микрофлуидна платформа во која сите процеси се контролирани со протокол на фреквенција кој ротира микроструктурирана подлога [110].Уредот LOAD се карактеризира со употреба на центрифугална сила како важна движечка сила.Течностите се исто така предмет на капиларни, Ојлерови и Кориолисови сили.Со помош на уред за центрифуга, анализите се вршат во континуирана работа со течност од радијална навнатре кон надворешна положба, со што се елиминира потребата од дополнителни надворешни цевки, пумпи, актуатори и активни вентили.Накратко, еден метод на контрола ја поедноставува работата.Силите кои делуваат на течноста во истиот микрофлуиден канал на исто растојание од центарот на оптоварување се еднакви, што овозможува повторување на структурата на каналот.Така, опремата LOAD е поедноставна и поекономична за дизајнирање и производство од конвенционалната LOCC опрема, додека реакциите се во голема мера независни и паралелизирани;сепак, поради високата механичка сила на центрифугалната опрема, достапниот материјал за чипови е ограничен и малите волумени се тешки.до автомобилот.Во исто време, повеќето LOAD уреди се дизајнирани само за еднократна употреба, што е скапо за откривање во големи размери [96, 117, 118, 119].
Во последниве децении, LOAD, кој се смета за еден од најперспективните микрофлуидни уреди, доби значително внимание од истражувачите и производителите.Така, LOAD доби широко прифаќање и се користи за молекуларна дијагностика на заразни патогени [120, 121, 122, 123, 124], особено за време на појава на COVID-19.На пример, на крајот на 2020 година, Џи и сор.[60] покажа директна RT-qPCR анализа за брзо и автоматизирано паралелно откривање на инфекции на SARS-CoV-2 и инфлуенца А и Б во примероци од брис од грло.Потоа Ксионг и сор.[74] претстави дискоидна микрофлуидна платформа интегрирана во LAMP за брзо, прецизно и истовремено откривање на седум човечки респираторни коронавируси, вклучувајќи го и SARS-CoV-2, во рок од 40 минути.На почетокот на 2021 година, де Оливеира и сор.[73] покажа центрифугален микрофлуиден чип со полистирен тонер, рачно управуван со ротатор на врвот на прстот, за RT-LAMP молекуларна дијагноза на СОВИД-19.Последователно, Дигнан и сор.[39] претстави автоматизиран пренослив микроуред за центрифуга за прочистување на РНК на SARS-CoV-2 директно од делови од букални брис.Медвед и сор.[53] предложи вграден систем за земање примероци на аеросол SARS-CoV-2 со мал волуменски ротирачки микрофлуиден флуоресцентен чип со ограничување за откривање од 10 копии/μL и минимален праг на циклус од 15 минути.Суарез и сор.[75] неодамна објави развој на интегрирана модуларна центрифугална микрофлуидна платформа за директно откривање на SARS-CoV-2 RNA во примероци од назофарингеален брис инактивирани со топлина со помош на LAMP.Овие примери ги покажуваат големите придобивки и ветувања на LOAD во молекуларната дијагностика на COVID-19.
Во 1945 година, Мулер и Клег [125] првпат ги претставија микрофлуидните канали на хартија користејќи филтер-хартија и парафин.Во 2007 година, групата Whitesides [126] ја создаде првата функционална хартиена платформа за тестирање на протеини и гликоза.Хартијата стана идеална подлога за микрофлуиди.Хартијата има својствени својства како што се хидрофилност и порозна структура, одлична биокомпатибилност, мала тежина, флексибилност, преклопување, ниска цена, леснотија на користење и практичност.Класичните µPAD се состојат од хидрофилни/хидрофобни структури изградени на хартиени подлоги.Во зависност од тродимензионалната структура, μPAD може да се поделат на дводимензионални (2D) и тродимензионални (3D) μPAD.2D µPAD се произведуваат со формирање на хидрофобни граници за да се формираат микрофлуидни канали, додека 3D µPAD обично се направени од купишта слоеви на 2D микрофлуидна хартија, понекогаш со превиткување хартија, техники на лизгање, отворени канали и 3D печатење [96].Водните или биолошките течности на μPAD првенствено се контролираат со капиларна сила без надворешен извор на енергија, што го олеснува претходно складирањето на реагенсите, ракувањето со примероците и откривањето на мултиплекс.Сепак, точната контрола на протокот и откривањето на мултиплекс се попречени од недоволната брзина на откривање, чувствителност и повторна употреба [96, 127, 128, 129, 130].
Како необична микрофлуидна платформа, μPAD е широко промовиран и развиен за молекуларна дијагноза на заразни болести како што се ХЦВ, ХИВ и САРС-КоВ-2 [131, 132].За селективно и чувствително откривање на HCV, Tengam et al.[133] разви нов биосензор базиран на флуоресцентна хартија користејќи високо специфична сонда за нуклеинска киселина базирана на пиролидинил пептид.Нуклеинските киселини се ковалентно имобилизирани на делумно оксидирана целулозна хартија со редуктивна алкилација помеѓу амино групите и алдехидните групи, а детекцијата се заснова на флуоресценција.Овие сигнали може да се читаат со специјално направен гаџет со пренослива флуоресцентна камера во комбинација со камера за мобилен телефон.Последователно, Лу и сор.[134] дизајнираше флексибилна електрода базирана на хартија базирана на никел/златни наночестички/јаглеродни наноцевки/поливинил алкохол органометални рамковни композити за откривање на целта на ХИВ со хибридизација на ДНК користејќи метиленско сино како ДНК редокс индикатор.Во поново време, Chowdury et al.[135] презентираше хипотетички дизајн на платформа за μPAD тестирање во точка на грижа со користење на сирова плунка на пациентот во комбинација со LAMP и пренослива технологија за сликање за откривање на аналитот COVID-19.
Тестовите за латерален проток ги водат флуидите со капиларните сили и го контролираат движењето на течноста со влажноста и карактеристиките на порозните или микроструктурните подлоги.Уредите за латерален проток се состојат од примерок, конјугат, инкубатор и детекција и абсорбентни влошки.Молекулите на нуклеинската киселина во LFA препознаваат специфични врзива кои се претходно складирани на местото на врзување и се врзуваат како комплекси.Како што течноста минува низ плочите за инкубација и откривање, комплексите се заробени од молекулите за фаќање лоцирани на линиите за тестирање и контрола, што покажува резултати што може да се прочитаат директно со голо око.Вообичаено, LFA може да се заврши за 2-15 минути, што е побрзо од традиционалното откритие.Поради посебниот механизам, LFA бара малку операции и не бара дополнителна опрема, што го прави многу лесен за користење.Лесно се произведува и минијатуризира, а цената на подлогите на база на хартија е помала.Сепак, се користи само за квалитативна анализа, а квантитативното откривање е многу тешко, а способноста за мултиплексирање и пропусната моќ се многу ограничени, а само една доволна нуклеинска киселина може да се открие во исто време [96,110,127].
Иако повеќето апликации на LFA се фокусирани на имуноанализи, употребата на LFA за молекуларна дијагностика кај микрофлуидните чипови е исто така ефикасна и популарна [136].Во случај на вирус на хепатитис Б, ХИВ и SARS-CoV-2 LFA Gong et al.[137] предложи платформа LFA со наночестички со зголемена конверзија и ја покажа разновидноста на оваа минијатуризирана и пренослива платформа преку чувствително и квантитативно откривање на повеќе цели како што е HBV нуклеинската киселина.Покрај тоа, Фу и сор.[138] покажа нов LFA базиран на површинска подобрена Раман спектроскопија за квантитативна анализа на ХИВ-1 ДНК при ниски концентрации.За брзо и чувствително откривање на САРС-КоВ-2, Лиу и сор.[85] разви микрофлуидно интегрирана RPA анализа на страничниот проток со комбинирање на RT-RPA и универзален систем за откривање страничен проток во единствен микрофлуиден систем.
Примената на различни микрофлуидни платформи варира во зависност од специфичните студии, искористувајќи ги целосно можностите и предностите на платформите.Со прифатливи вентили, пумпи и канали, LOCC е најсеопфатната платформа за разновидност на апликации и интероперабилност со најголем простор за развој.Затоа, се надеваме и препорачуваме како прв обид да се направат најновите студии во LOCC и да се оптимизираат условите.Дополнително, се очекува да бидат откриени и употребени поефикасни и попрецизни методи во системот.LOAD се истакнува во прецизната контрола на течностите од постоечките LOCC уреди и покажува уникатни предности во единечните погони со центрифугална сила без потреба од надворешни погони, додека паралелните одговори може да се одделат и синхронизираат.Така, во иднина, LOAD ќе стане главната микрофлуидна платформа со помалку рачни операции и позрели и автоматизирани технологии.Платформата µPAD ги комбинира придобивките од LOCC и материјалите базирани на хартија за евтина дијагностика за еднократна употреба.Затоа, идниот развој треба да се фокусира на погодни и добро воспоставени технологии.Покрај тоа, LFA е добро прилагоден за откривање голо око, ветувајќи дека ќе ја намали потрошувачката на примероци и ќе го забрза откривањето.Детална споредба на платформата е прикажана во Табела 2.
Дигиталните анализи го делат примерокот на многу микрореактори, од кои секој содржи дискретен број целни молекули [139, 140].Дигиталните анализи нудат значајни предности за извршување на апсолутна квантитација со изведување на илјадници паралелни биохемиски експерименти истовремено и поединечно во оддели на микронска скала наместо во континуирана фаза.Во споредба со традиционалните микрофлуиди, реакциите на одделот може да го намалат волуменот на примерокот, да ја зголемат ефикасноста на реакцијата и лесно да се интегрираат со други аналитички методи без потреба од канали, пумпи, вентили и компактни дизајни [141, 142, 143, 144, 145, 146, 147].Следниве два методи се користат во дигиталните анализи за да се постигне униформа и прецизно одвојување на растворите, вклучувајќи реагенси и примероци како што се клетки, нуклеински киселини и други честички или молекули: (1) капка емулзии кои ја искористуваат нестабилноста на течниот интерфејс;(2) поделбата на низата се врши со геометриските ограничувања на уредот.Во првиот метод, капките кои содржат реагенси и примероци во микроканали може да се создадат со пасивни методи како што се ко-струја, вкрстен проток, фокусирање на протокот, етапно емулзификација, микроканална емулзификација и мембрани преку вискозни сили на смолкнување и емулзификација со промена на каналот.локализација [143, 145, 146, 148, 149] или користење на активни методи [150, 151], кои внесуваат дополнителна енергија преку електрична, магнетна, топлинска и механичка контрола.Во вториот пристап, најдобрата униформност на волуменот на течноста во микрофлуидните комори е споделена со одржување на просторни структури со иста големина, како што се микројами и површински низи [152,153,154].Имено, капките се главни проточни делови кои исто така може да се генерираат и манипулираат на низи на електроди базирани на дигитална микрофлуидика (DMF).Електромокрењето на диелектриците е една од најдобро проучените теории за DMF, бидејќи електромокрењето на диелектриците овозможува прецизна манипулација со поединечни капки, контролирајќи го обликот на течноста и асиметричните електрични сигнали кои минуваат низ различни страни [141, 144].Главните операции со капки во DMF вклучуваат сортирање, разделување и спојување [151, 155, 156], што може да се примени во различни полиња на анализа, особено во молекуларната детекција [157, 158, 159].
Дигиталната детекција на нуклеинска киселина е молекуларна дијагностичка технологија од трета генерација која следи конвенционална PCR и квантитативна PCR во реално време (qPCR), паралелно со секвенционирање со висока моќност и течна биопсија.Во последните две децении, дигиталните нуклеински киселини брзо се развија во полето на молекуларна дијагностика на заразни патогени [160, 161, 162].Апсолутна квантификација на детекцијата на дигитална нуклеинска киселина започнува со пакување на примероците и реагенсите во одделни оддели за да се осигура дека секоја целна секвенца има иста веројатност да влезе во секој поединечен оддел.Теоретски, на секој дел може да му се доделат повеќе целни секвенци или можеби нема да има независен систем за микрореакција.Преку различните сензорни механизми опишани погоре, преградите со микробни целни секвенци кои генерираат сигнали над одреден праг може да се визуелизираат со голо око или со машина и се означени како позитивни, додека другите прегради кои генерираат сигнали под прагот се означени како позитивни. .негативни, кои го прават сигналот за секоја секција бул.Така, со пресметување на бројот на создадени прегради и стапката на позитивни резултати по реакцијата, оригиналните копии од примероците за тестирање може да се усогласат со помош на формулата за дистрибуција на Поасон без потреба од стандардна крива, која е потребна за рутински квантитативни анализи, како што се како qPCR.[163] Во споредба со традиционалните молекуларни дијагностички методи, откривањето на дигиталната нуклеинска киселина има повисок степен на автоматизација, поголема брзина и чувствителност на анализа, помалку реагенси, помала контаминација и поедноставен дизајн и производство.Поради овие причини, употребата на дигитални анализи, особено методи базирани на капка, за молекуларна дијагностика, комбинирајќи техники за засилување и читање сигнал, е добро проучена за време на критичната појава на САРС-КоВ-2.На пример, Јин и сор.[164] комбинирани капки дигитални и брзи методи на PCR за откривање на гените ORF1ab, N и RNase P во SARS-CoV-2 во микрофлуиден чип.Имено, системот можеше да идентификува позитивен сигнал во рок од 115 секунди, што е побрзо од конвенционалната PCR, што укажува на неговата ефикасност во откривањето на точката на грижа (Слика 7а).Донг и сор.[165], Соу и сор.[157], Чен и сор.[166] и Алтери и сор.[167] исто така примени капка дигитална PCR (ddPCR) за откривање на САРС-КоВ-2 во микрофлуиден систем со импресивни резултати.За понатамошно подобрување на стапката на откривање, Шен и сор.[168] постигна сликање со чип базирано на ddPCR за само 15 секунди без употреба на техники за шиење слики, забрзувајќи го технолошкиот процес ddPCR од лабораторија до апликација.Не се применуваат само методи на термичко засилување како што е PCR, туку се користат и методи за изотермално засилување за да се поедностават условите за реакција и брзиот одговор.Лу и сор.[71] разви SlipChip за анализа на капки, способен да генерира капки со различни големини при високи густини во еден чекор и да ги квантифицира нуклеинските киселини SARS-CoV-2 со помош на дигитална ЛАМП (Слика 7б).Како технологија што брзо се развива, CRISPR може да игра важна улога и во откривањето на дигиталната нуклеинска киселина преку практично колориметриско сликање без потреба од дополнителни дамки од нуклеинска киселина.Акерман и сор.разви комбинаторна матрична реакција за мултиплексна евалуација на нуклеинските киселини.[158] откри 169 вируси поврзани со човекот, вклучително и SARS-CoV-2, во капки што содржат реагенси за откривање на нуклеинска киселина базирани на CRISPR-Cas13 во анализа на микробулари (Слика 7в).Покрај тоа, изотермалното засилување и технологијата CRISPR може да се користат во истиот систем за да се комбинираат придобивките од двете.Парк и сор.[169] Дигитална анализа CRISPR/Cas12a беше развиена во комерцијален микрофлуиден чип за откривање на извлечен и убиен од топлина SARS-CoV-2 врз основа на едностепен RT-RPA со пократко и повисоко откривање сигнал до позадина временски сооднос., поширок динамички опсег и подобра чувствителност (сл. 7г).Некои описи на овие примери се дадени во Табела 3.
Типична дигитална платформа за откривање на нуклеинска киселина.a Брзиот работен тек на дигитална PCR се состои од четири клучни чекори: подготовка на примерокот, дистрибуција на реакционата смеса, процес на засилување и целна квантификација (прилагодено од [164]).б Шематски прикажува анализа на капките SlipChip за формирање на капки при висока густина (прилагодено од [71]).c CARMEN-Cas дијаграм на работен тек13 (прилагодено од [158]).г Преглед на напредно дигитално откривање вируси со CRISPR/Cas во еден сад (прилагодено од [169]).W/O вода-во-масло, полидиметилсилоксан PDMS, PCR полимеразна верижна реакција, DAQ собирање податоци, PID пропорционален интегрален дериват, CARMEN комбинаторна матрична реакција за евалуација на мултиплекс нуклеинска киселина, SARS-CoV-2, тежок акутен респираторен синдром, коронавирус 2, RT Засилување на реверзна транскриптаза рекомбиназа полимераза-RPA, S/B сигнал во позадина
Време на објавување: 15-ти септември 2022 година
