Вести

Ви благодариме што ја посетивте Nature.com.Верзијата на прелистувачот што ја користите има ограничена поддршка за CSS.За најдобро искуство, препорачуваме да користите ажуриран прелистувач (или да го оневозможите режимот на компатибилност во Internet Explorer).Во меѓувреме, за да обезбедиме континуирана поддршка, ќе ја направиме страницата без стилови и JavaScript.
Методите на ензимско обележување на близината базирани на активирани естери или фенокси радикали се широко користени за мапирање на субклеточните протеоми и протеинските интерактори во живите клетки.Сепак, активираните естери се помалку реактивни, што резултира со широк радиус на означување, а фенокси радикалите генерирани со третман со пероксид може да се мешаат со редокс патеките.Овде известуваме за методот на фотоактивирање зависна од означување на близина (PDPL) развиен со генетско поврзување на протеинот фотосензибитор miniSOG со протеин од интерес.Активирани од сина светлина и контролирани од времето на експозиција, се генерира единечен кислород, а потоа се постигнува просторно-временско разрешено обележување на остатоците од хистидин со анилинската сонда.Ја демонстрираме неговата висока верност преку мапирање на протеом специфично за органели.Споредба рамо до рамо на PDPL со TurboID покажува поконкретно и посеопфатно протеомско покривање на PDPL.Следно, применивме PDPL на транскрипцискиот коактиватор BRD4 и Е3 Паркин лигаза поврзан со болеста и најдовме претходно непознати интерактори.Со скрининг на прекумерна експресија, два непознати супстрати, Ssu72 и SNW1, беа идентификувани за Паркин, чија деградација е посредувана од патеката убиквитинација-протеазом.
Точната карактеризација на протеинските мрежи лежи во основата на многу основни клеточни процеси.Затоа, високо прецизното просторно-временско мапирање на протеинските интеракции ќе обезбеди молекуларна основа за дешифрирање на биолошките патишта, патологијата на болеста и нарушување на овие интеракции за терапевтски цели.За таа цел, методите способни за откривање на временски интеракции во живите клетки или ткива се многу пожелни.Масовната спектрометрија за прочистување на афинитет (AP-MS) историски се користела за да се идентификуваат врзувачките партнери на протеините од интерес (POI).Со развојот на методите на квантитативна протеомика, создадена е Bioplex3.0, најголемата база на податоци за протеински мрежи базирани на AP-MS.Иако AP-MS е многу моќен, чекорите на лиза и разредување на клетките во работниот тек се пристрасни кон слаби и минливи сврзувачки интеракции и воведуваат пост-лиза артефакти како што се лажните парови на интеракција на кои им недостига разделување пред лизата.
За да се решат овие прашања, развиени се неприродни аминокиселини (UAA) со вкрстени групи и ензимски платформи за етикетирање во близина (PL) (на пр. APEX и BioID)5.Иако методот UAA е успешно применет во многу сценарија и дава информации за директни протеински лепила, сепак е потребна оптимизација на местото за вметнување UAA.Што е уште поважно, тоа е стехиометриски метод на етикетирање на кој му недостига каталитички пресврт на настаните за етикетирање.Спротивно на тоа, ензимските PL методи, како што е методот BioID, ја спојуваат конструираната биотинска лигаза со POI7, која последователно го активира биотинот за да формира реактивен биотинил-AMP естерски посредник.Така, ензимот катализира и ослободува активиран биотински „облак“ кој ги означува проксималните остатоци од лизин.Сепак, на BioID му требаат повеќе од 12 часа за да се добие доволен означен сигнал, што ја исклучува неговата употреба со временска резолуција.Користејќи насочена еволуција базирана на приказ на квасец, TurboID беше дизајниран врз основа на BioID за да биде поефикасен, овозможувајќи ефикасно означување со биотин во рок од 10 минути, овозможувајќи да се проучуваат подинамични процеси.Бидејќи TurboID е многу активен и нивоата на ендогени биотин се доволни за означување на ниско ниво, етикетирањето во позадина станува потенцијален проблем кога е потребно високо засилено и временски означување со додавање на егзоген биотин.Дополнително, активираните естери се слабо реактивни (t1/2 ~5 min), што може да доведе до голем радиус на обележување, особено по заситеноста на соседните протеини со биотин 5. Во друг пристап, генетска фузија на инженерската аскорбат пероксидаза (т.е. биотин- фенолни радикали и овозможува означување на протеините во рок од една минута 9,10. APEX е широко користен за да се идентификуваат субклеточните протеоми, мембрански протеински комплекси и цитосолни сигнални протеински комплекси11, 12. Сепак, потребата за високи концентрации на пероксиди може да влијае на редокс протеините или патеките, нарушувајќи клеточни процеси.
Така, нов метод способен да генерира пореактивни видови супресија со означен радиус со висока просторна и временска точност без значително нарушување на клеточните патишта ќе биде важен додаток на постоечките методи. Меѓу реактивните видови, единечниот кислород го разбуди нашето внимание поради неговиот краток животен век и ограничениот радиус на дифузија (t1/2 < 0,6 µs во клетките)13. Меѓу реактивните видови, единечниот кислород го разбуди нашето внимание поради неговиот краток животен век и ограничениот радиус на дифузија (t1/2 < 0,6 µs во клетките)13. Среди активных форма наше внимание привлек синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограничени радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс во клетках)13. Меѓу активните форми, единечниот кислород го привлече нашето внимание поради неговиот краток животен век и ограничениот радиус на дифузија (t1/2 <0,6 µs во клетките)13.在活性物质中，单线态氧因其寿命短和扩散半径有限（细胞中有限（细胞中摵〵中摏瀻而中摏瀚耆而3５ 1/2 < 0,6 µs）而引起了我们的注意13 Среди активных форма наше внимание привлекает синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограничени радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс во клетках). Меѓу активните форми, единечен кислород го привлекува нашето внимание поради неговиот краток животен век и ограничениот радиус на дифузија (t1/2 < 0,6 μs во клетките).Пријавено е дека единечен кислород случајно оксидира метионин, тирозин, хистидин и триптофан, што го прави поларен 14,15 за прикачување на сонди базирани на амин или тиол16,17.Иако единечен кислород е користен за означување на РНК на субклеточниот оддел, стратегиите за пренамена на ендогени маркери за близина на POI остануваат неистражени.Овде, ја претставуваме платформата наречена етикетирање близина зависно од фотоактивирање (PDPL), каде што користиме сина светлина за да ги осветлиме POI-ите споени со фотосензибилизатор miniSOG и да активираме единечно генерирање кислород за оксидирање на проксималните остатоци, проследено со модификации што содржат амини за оксидација на хемиските сонди во средно живи клетки..Тестиравме група хемиски сонди за да ја максимизираме специфичноста на ознаката и идентификувавме места за модификација користејќи отворен работен тек на протеомика.Споредба рамо до рамо на PDPL со TurboID покажува поконкретно и посеопфатно протеомско покривање на PDPL.Го применивме овој пристап за специфични органели маркери на субклеточниот протеом и општа протеомска идентификација на врзувачките партнери за епигенетскиот регулаторен протеин BRD4 поврзан со ракот и Е3 лигазата Паркин поврзана со Паркинсонова болест, што потврди и позната и непозната мрежа на протеини интеракции..Способноста на PDPL да ги препознава супстратите на Е3 во големите протеински комплекси претставува ситуација во која е потребно препознавање на индиректни врзувачи.Два непознати паркин супстрати со посредство на убиквитинација-протеазом се потврдени in situ.
Фотодинамичката терапија (PDT)19 и ласерската инактивација со помош на хромофор (CALI)20, во која зрачењето на светлината со фотосензибилизатори генерира единечен кислород, може да ги инактивира целните протеини или да предизвика клеточна смрт.Бидејќи единечен кислород е високо реактивна супстанција со теоретско дифузно растојание од околу 70 nm, просторно ограничената оксидација околу фотосензибилизаторот може да се контролира.Врз основа на овој концепт, решивме да користиме единечен кислород за да постигнеме блиско означување на протеинските комплекси во живите клетки.Развивме PDPL хемопротеомски пристап за исполнување на четири функции: (1) да го катализираме создавањето на активен единечен кислород сличен на ензимскиот пристап PL;(2) да обезбеди временски решени етикети при иницирање на светлина;(3) со промена (4) Избегнувајте користење на ендогени кофактори (како што е биотин) за да се намали позадината или користете високо вознемирувачки егзогени реагенси (како што се пероксидите) за да се минимизира клеточната изложеност на еколошки стрес.
Фотосензибилизаторите може да се поделат во две категории вклучувајќи флуорофори со мала молекуларна тежина (на пр. роза бенгал, метиленско сино)22 и генетски кодирани мали протеини (на пр. miniSOG, KillerRed)23.За да постигнеме модуларен дизајн, ја развивме првата генерација PDPL платформа со додавање на протеини од фотосензибилизатор (PS) на POI24,25 (Слика 1а).Кога ќе се зрачи со сина светлина, единечен кислород ги оксидира проксималните нуклеофилни амино киселински остатоци, што резултира со поларитет што е електрофилен и понатаму може да реагира со нуклеофилите со аминска сонда16,17.Сондата е дизајнирана со алкинска рачка за да овозможи кликање на хемијата и влечење надолу за LC/MS/MS карактеризација.
Шематска илустрација на означување на протеинските комплекси со посредство на miniSOG.Кога се изложени на сина светлина, клетките кои изразуваат miniSOG-POI генерираат единечен кислород, кој ги модифицира протеините кои дејствуваат, но не и неврзувачките протеини.Средните производи на фотооксидација се пресретнуваат со релејни етикети на аминската хемиска сонда за да се формираат ковалентни адукти.Алкинилната група на хемиската сонда овозможува кликање на хемијата за збогатување со влечење надолу проследено со квантификација LC-MS/MS.б Хемиска структура на амински сонди 1-4.c Репрезентативна флуоресцентна гел анализа на митохондријални локализирани протеомски маркери посредувани од miniSOG со користење на сонди 1-4 и релативна квантификација врз основа на гел дензитометрија.Односот сигнал-позадина на хемиските сонди беше проценет со користење на негативни контролни експерименти со исклучок на сината светлина или со користење на HEK293T ќелии без miniSOG изразување.n = 2 биолошки независни примероци.Секоја точка претставува биолошка реплика.г.n = 3 биолошки независни примероци.Секоја точка претставува биолошка реплика.Централните линии и мустаќите претставуваат средна и ± стандардна девијација.CBB: Coomassie Brilliant Blue.д Конфокална слика на единечен кислород со далеку-црвена дамка Si-DMA.Лента за скала: 10 µm.Слики со гел и конфокални експерименти беа независно повторени најмалку двапати со слични резултати.
Прво ја тестиравме способноста на зрелите фотосензибилизатори miniSOG26 и KillerRed23, стабилно изразени во HEK293T, да посредуваат во означувањето на протеомот со пропаргиламин како хемиска сонда (Дополнителна слика 1а).Анализата на флуоресценција на гел покажа дека означување на целиот протеом е постигнато со употреба на зрачење на miniSOG и сина светлина, додека не е забележан видлив производ за означување со KillerRed.За да го подобриме односот сигнал-позадина, потоа тестиравме збир на хемиски сонди кои содржат анилин (1 и 3), пропиламин (2) или бензиламин (4).Забележавме дека самите клетки HEK293T имале повисок позадински сигнал во споредба со без сина светлина, веројатно поради ендогениот рибофлавин фотосензибитор, флавин мононуклеотид (FMN) 27 . Хемиските сонди 1 и 3 базирани на анилин дадоа подобра специфичност, при што HEK293T стабилно изразува miniSOG во митохондриите покажувајќи >8 пати зголемување на сигналот за сондата 3, додека сондата 2 што се користи во методот за означување РНК CAP-seq прикажува само ~2,5- зголемување на сигналот на пати, најверојатно поради различните преференции за реактивност помеѓу РНК и протеинот (сл. 1б, в). Хемиските сонди 1 и 3 базирани на анилин дадоа подобра специфичност, при што HEK293T стабилно изразува miniSOG во митохондриите покажувајќи >8 пати зголемување на сигналот за сондата 3, додека сондата 2 што се користи во методот за означување РНК CAP-seq прикажува само ~2,5- зголемување на сигналот на пати, најверојатно поради различните преференции за реактивност помеѓу РНК и протеинот (сл. 1б, в).Хемиските сонди 1 и 3 базирани на анилин покажаа подобра специфичност: HEK293T, кој стабилно изразува miniSOG во митохондриите, покажува повеќе од 8 пати зголемување на сигналот за сондата 3, додека сондата 2, користена во методот на означување CAP-seq RNA, само покажува ~ 2,5 пати зголемување на сигналот, веројатно поради различните преференции за реактивност помеѓу РНК и протеинот (сл. 1б, в).基于 苯胺 的 化学 探针 1 和 3 具有 更 好 的 特异性 ， hek293t 在 线 中 稳定 表达 表达 minisog ， 探针 3 的 信号 增加> 8 倍 ， 而 于 rna 标记 方法 方法 cap-seq 的 探针 2 仅 仅 显示2.5-倍信号增加，可能是由于RNA 和蛋白质之间的不同反应偏好（图1b，c）。基于 苯胺 的 化学 探针 1 和 3 具有 更 的 特异性 ， hek293t 在 粒体 稳定 表达 表达 minisog ， 探针 探针 3 的 信号 增加 增加> 8 倍 而 于 于 rna 标记 cap-eq 的 2 仅 ~ ~ ~ 2,5 -倍信号增加，可能是由于RNAХемиските сонди 1 и 3 базирани на анилин имаа подобра специфичност, HEK293T стабилно изразува miniSOG во митохондриите, а сондата 3 имаше над 8 пати зголемување на сигналот, додека сондата 2 за методот на означување CAP-seq RNA покажа само ~ 2,5 пати зголемување.во сигналот, веројатно поради различните преференции за реакција помеѓу РНК и протеинот (сл. 1б, в).Дополнително, беа тестирани изомерите на сондата 3 и хидразинските сонди (сонди 5, 6, 7), потврдувајќи ја оптимизацијата на сондата 3 (Дополнителна слика 1б, в).Слично на тоа, анализата на флуоресценција во гел откри други оптимизирани експериментални параметри: бранова должина на зрачење (460 nm), концентрација на хемиска сонда (1 mM) и време на зрачење (20 мин) (Дополнителна слика 2а-в).Испуштањето на која било компонента или чекор во протоколот PDPL резултираше со значително враќање на сигналот во позадина (сл. 1г).Забележително, означувањето на протеините беше значително намалено во присуство на натриум азид или тролокс, за кои е познато дека го гасат единечен кислород.Присуството на D2O, за кое е познато дека го стабилизира единствениот кислород, го подобрува сигналот за означување.За да се истражи придонесот на другите реактивни кислородни видови во етикетирањето, додадени се манитол и витамин Ц за да се воспостават чистачи на радикали на хидроксил и супероксид, соодветно, 18, 29, но не беше откриено дека тие го намалуваат етикетирањето.Додавањето на H2O2, но не и осветлувањето, не резултираше со означување (Дополнителна слика 3а).Флуоресцентното сликање со единечен кислород со Si-DMA сонди го потврди присуството на единечен кислород во жицата HEK293T-miniSOG, но не и во оригиналната жица HEK293T.Дополнително, mitoSOX Red не можеше да открие производство на супероксид по осветлувањето (сл. 1е и дополнителна слика 3б) 30. Овие податоци силно сугерираат дека единечниот кислород е главниот реактивен кислороден вид одговорен за последователно протеомско обележување.Цитотоксичноста на PDPL беше проценета вклучувајќи зрачење со сина светлина и хемиски сонди, и не беше забележана значајна цитотоксичност (Дополнителна слика 4а).
Со цел да се проучи механизмот за означување и да се овозможи протеомска идентификација на протеинските комплекси со користење на LC-MS/MS, прво треба да одредиме кои амино киселини се модифицирани и делта масата на ознаките на сондата.Пријавено е дека метионин, хистидин, триптофан и тирозин се модифицирани со единечен кислород14,15.Ние го интегрираме работниот тек на TOP-ABPP31 со непристрасното отворено пребарување обезбедено од компјутерската платформа FragPipe базирана на MSFragger32.По единечна модификација на кислородот и означување на хемиската сонда, хемијата на кликање беше изведена со користење на етикета за редукција на биотин која содржи расцеплив поврзувач, проследено со истегнување на неутравидин и дигестија на трипсин.Модифицираниот пептид, сè уште врзан за смолата, беше фоторасцепен за LC-MS/MS анализа (слика 2а и дополнителни податоци 1).Голем број на модификации се случија низ протеомот со над 50 совпаѓања на пептидната карта (PSM) наведени (сл. 2б).Изненадувачки, забележавме само модификација на хистидин, веројатно поради повисоката реактивност на оксидираниот хистидин кон анилинските сонди од другите амино киселини.Според објавениот механизам на оксидација на хистидин со единечен кислород,21,33 предложената структура на делта маса од +229 Da одговара на аддуктот на сондата 3 со 2-оксо-хистидин по две оксидации, додека +247 Da е производ на хидролиза од +229 Da (Дополнителна слика 5).Евалуацијата на спектарот MS2 покажа висока веродостојност за идентификација на повеќето y и b јони, вклучувајќи ја и идентификацијата на модифицираните јони на фрагмент (y и b) (сл. 2c).Анализата на контекстот на локалната секвенца на PDPL-модифицирани хистидини откри умерена претпочитаност на мотивот за мали хидрофобни остатоци на позиции ±1 (Дополнителна слика 4б).Во просек, 1,4 хистидини беа идентификувани по протеин, а местата на овие маркери беа одредени со помош на површина достапна за растворувач (SASA) и анализа на релативна достапност на растворувач (RSA) (Дополнителна слика 4c,d).
Непристрасен работен тек за проучување на преостанатата селективност со користење на компјутерската платформа FragPipe напојувана од MSFragger.Расклопливи поврзувачи се користат во Click chemistry за да се овозможи фоторасцепување на модифицираните пептиди од стрептавидинската смола.Беше започната отворена потрага за да се идентификуваат бројни модификации, како и релевантни остатоци.б Доделете ја масата на модификации што се случуваат низ протеомот.Пептидно мапирање PSM.c MS2 спектрална прибелешка на местата на хистидин модифицирани со сонда 3. Како репрезентативен пример, ковалентна реакција со сонда 3 додаде +229,0938 Da на модифицираната амино киселина.d Анализа на мутации што се користи за тестирање на PDPL маркери.PRDX3 (H155A, H225A) и PRDX1 (H10A, H81A, H169A) беа трансфицирани со плазмиди од див тип за откривање анти-Flag.e Синтетичкиот пептид беше реагиран со прочистен miniSOG во присуство на сонда 3 и соодветните производи со Δm +247 и +229 беа забележани во LC-MS спектарот.ѓ Ин витро интеракции протеин-протеин моделирани со miniSOG-6xHis-ознака и анти-6xHis антитела.Антибиотин (стрептавидин-HRP) и вестерн блот анализа против глушец на комплекси на антитела miniSOG-6xHis/anti-6xHis означени со сонда 3, во зависност од времето на изложување на светлина.Етикетите за поединечни протеини се изразени во соодветната молекуларна тежина: LC антитела лесен ланец, HC антитела тежок ланец.Овие експерименти беа независно повторени најмалку двапати со слични резултати.
За биохемиска верификација на местото на означување, PRDX3 и PRDX1 идентификувани со масена спектрометрија беа променети од хистидин во аланин и споредени со дивиот тип во анализите на трансфекција.Резултатите од PDPL покажаа дека мутацијата значително го намали етикетирањето (сл. 2г).Во меѓувреме, пептидните секвенци идентификувани во отвореното пребарување беа синтетизирани и реагираа ин витро со прочистен miniSOG во присуство на сондата 3 и сина светлина, давајќи производи со поместување на масата од +247 и +229 Da кога беа откриени со LC-MS (сл. 2д).).За да тестираме дали проксималните протеини во интеракција би можеле да се означат in vitro како одговор на фотоактивацијата на miniSOG, дизајниравме вештачка анализа на близина со интеракција помеѓу протеинот miniSOG-6xHis и анти-His моноклоналното антитело in vitro (Слика 2f).Во оваа анализа, очекувавме проксимално означување на тешките и лесните синџири на антитела со miniSOG.Всушност, анти-глувчето (препознавајќи ги тешките и лесните синџири на антителата означени со анти-6xHis) и вестерн блотовите со стрептавидин покажаа силна биотинилација на тешките и лесните синџири.Имено, забележавме автобиотинилација на miniSOG поради ознаката 6xHis и вкрстените врски помеѓу лесните и тешките синџири, што може да биде поврзано со претходно опишаниот јаз помеѓу проксималниот одговор на лизин и 2-оксо-хистидин.Како заклучок, заклучуваме дека PDPL го модифицира хистидинот на начин зависен од близината.
Нашата следна цел беше да го карактеризираме субклеточниот протеом за да ја тестираме специфичноста на in situ етикетирањето.Затоа, ние стабилно изразивме miniSOG во јадрото, митохондријалната матрица или надворешната ER мембрана на HEK293T клетките (сл. 3а).Анализата на флуоресценција на гел откри изобилство означени ленти на три субклеточни локации, како и различни модели на етикетирање (сл. 3б).Анализата со флуоресцентна слика покажа висока специфичност на PDPL (сл. 3в).Работниот тек на PDPL беше проследен со реакции на кликање со родамински бои за да се разграничат субклеточните протеоми користејќи флуоресцентна микроскопија, а PDPL сигналите беа колокализирани со DAPI, митохондријални тракери или ER тракери, потврдувајќи ја високата верност на PDPL.За трите локации на органели, споредбата рамо до рамо на PDPL со TurboID користејќи вестерн блот на авидин покажа дека PDPL е означена поконкретно во споредба со нивните соодветни контроли.Во услови на PDPL, се појавија повеќе означени ленти, што укажува на повеќе протеини означени со PDPL (Дополнителна слика 6а-г).
Шематски приказ на означување на протеом специфично за органели посредувано од miniSOG.miniSOG ја таргетира митохондријалната матрица преку фузија на N-терминалните 23 аминокиселини на човечки COX4 (mito-miniSOG), јадрото преку фузија на H2B (јадро-miniSOG) и Sec61β преку цитоплазматската страна на ER мембраната (ER-miniSOG ).Индикациите вклучуваат сликање со гел, конфокално снимање и масена спектрометрија.б Репрезентативни гел слики на три PDPL профили специфични за органела.CBB Coomassie Brilliant Blue.в Репрезентативни конфокални слики на HEK293T клетки кои стабилно изразуваат miniSOG со различни субклеточни локализации откриени од антитела означени со V5 (црвено).Субклеточните маркери се користат за митохондриите и ЕР (зелено).Работниот тек на PDPL вклучува откривање на miniSOG (жолти) означени субклеточни протеоми со користење на хемијата на кликање на Cy3-азид.Лента за скала: 10 µm.г Вулкански заплетови на протеоми означени со PDPL во различни органели квантифицирани со неозначена квантификација (n = 3 независни биолошки експерименти).На вулкански парцели се користеше студентски т-тест со две опашки.Како негативна контрола се користеше див тип HEK293T. Значително променетите протеини се означени со црвено (p <0,05 и >2 пати разлика во интензитетот на јоните). Значително променетите протеини се означени со црвено (p <0,05 и >2 пати разлика во интензитетот на јоните). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и >2-кратна разница во интензивности ионов). Значително изменетите протеини се означени со црвено (p <0,05 и >2 пати разлика во интензитетот на јоните).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05 和> 2 倍离子强度差异）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратна разница во јоној силе). Значително изменетите протеини се означени со црвено (p <0,05 и > 2-кратна разлика во јонската јачина).Поврзани протеини важни за HEK293T-miniSOG, но не важни за HEK293T се прикажани со зелена боја.д Анализа на специфичноста на протеомските збирки на податоци од експериментите г.Вкупниот број на статистички значајни протеини во секоја органела (црвени и зелени точки) е означен на врвот.Хистограмите покажуваат протеини локализирани во органели врз основа на MitoCarta 3.0, GO анализа и A. Ting et al.луѓе.Одделни збирки на податоци за митохондриите, јадрата и ЕР.Овие експерименти беа независно повторени најмалку двапати со слични резултати.Необработените податоци се обезбедуваат во форма на датотеки со необработени податоци.
Охрабрени од резултатите од гелот и сликите, квантификацијата без ознака беше искористена за квантифицирање на идентификуваниот протеом во секоја органела (Дополнителни податоци 2).Нетрансфектиран HEK293T се користеше како негативна контрола за одземање на маркери во позадина. Анализата на заплетот на вулканите прикажа значително збогатени протеини (p <0,05 и >2-кратен интензитет на јони), како и единечни протеини кои се присутни само во линиите што изразуваат miniSOG (сл. 3d црвени и зелени точки). Анализата на заплетот на вулканите прикажа значително збогатени протеини (p <0,05 и >2-кратен интензитет на јони), како и единечни протеини кои се присутни само во линиите што изразуваат miniSOG (сл. 3d црвени и зелени точки). Анализ графика вулкана показал значительно обогащенные белки (p <0, 05 и > 2-кратная интенсивность ионов), а также одиночные белки, которые присутствуют только в линиях, кратка СОГ, икспреси. Анализата на вулканската парцела покажа значително збогатени протеини (p<0,05 и >2-кратен интензитет на јони) како и единечни протеини кои се присутни само во линиите што изразуваат miniSOG (сл. 3d, црвени и зелени точки).火山图 分析 显示 出 显着 的 蛋白质 蛋白质 （p <0,05 和> 2 倍 离子） 以及 仅 存 在于 minisog 表达 系 中 的 蛋白质 （图 3d 红色 和）。火山图 分析 显示 出 显着 蛋白质 （（p <0,05 和> 2 倍 离子 强度 仅 存 在于 在于 minisog 表达 系 的 单一 （图 3d 红色 绿色点 。。。））））））））））） Анализ графика вулкана выявил значительно обогащенные белки (p <0, 05 и> 2x ионная сила), а также отдельные белки, присутствующие только в экспрессионной линии miniSOG и. Анализата на заплетот на вулканите откри значително збогатени протеини (p<0,05 и >2x јонска јачина) како и единечни протеини присутни само во линијата на изразување miniSOG (црвени и зелени точки на Сл. 3d).Комбинирајќи ги овие податоци, идентификувавме 1364, 461 и 911 статистички значајни нуклеарни, митохондријални и ER надворешни мембрански протеини, соодветно.За да ја анализираме точноста на PDPL локализирана со органела, користевме MitoCarta 3.0, Gene Ontology (GO) анализа и A. Ting et al.збир на податоци8 беше користен за митохондриите, јадрото и ER за тестирање на специфичноста на органелата на откриените протеини, што одговара на точност од 73,4, 78,5 и 73,0% (сл. 3e).Специфичноста на PDPL потврдува дека PDPL е идеална алатка за идентификација на протеоми специфични за органела.Забележително, поднесувањето на анализата на идентификуваните митохондријални протеини покажа дека заробениот протеом главно бил дистрибуиран во матрицата и внатрешната мембрана (226 и 106, соодветно), што претставува 91,7% (362) од вкупниот број на идентификувани митохондријални протеини.дополнително беше потврдено високо ниво на PDPL (Дополнителна слика 7а).Слично на тоа, субнуклеарната анализа покажа дека заробениот протеом главно бил дистрибуиран во јадрото, нуклеоплазмата и јадрото (Дополнителна слика 7б).Нуклеарната протеомска анализа со сигнален пептид за нуклеарна локализација (3xNLS) покажа слична точност на конструкцијата H2B (Дополнителна слика 7c-h).За да се одреди специфичноста на PDPL маркерот, нуклеарниот ламинин А беше избран како подискретно локализирана стапица на POI7.PDPL идентификуваше 36 значително збогатени протеини, од кои 12 протеини (30,0% вклучително и ламин А) беа добро карактеризирани протеини со интеракција со ламин А, нотирани од базата на податоци String, со повисок процент од методот BioID (122 протеини) 28 од 28. , 22,9 %) 7. Нашиот метод идентификуваше помалку протеини, веројатно поради ограничените области за означување, што беше овозможено со поактивен единечен кислород.Анализата на GO покажа дека идентификуваните протеини главно се лоцирани во нуклеоплазмата (26), нуклеарната мембрана (10), нуклеарната мембрана (9) и нуклеарните пори (5).Збирно, овие нуклеарно локализирани протеини сочинуваат 80% од збогатените протеини, дополнително покажувајќи ја специфичноста на PDPL (Дополнителна слика 8а-г).
Откако ја утврдивме способноста на PDPL да врши означување на близина во органели, потоа тестиравме дали PDPL може да се користи за анализа на партнерите за врзување на POI.Конкретно, се обидовме да ја дефинираме PDPL анализата на цитосолните протеини, кои се сметаат за потешки цели од нивните мембрански локализирани колеги поради нивната високо динамична природа.Бромодоменот и екстратерминалниот (BET) протеин BRD4 го привлече нашето внимание поради неговата клучна улога во различни болести 35, 36 .Комплексот формиран од BRD4 е транскрипциски коактиватор и важна терапевтска цел.Со регулирање на изразувањето на факторите на транскрипција c-myc и Wnt5a, се смета дека BRD4 е клучна детерминанта на акутна миелоидна леукемија (AML), мултиплекс миелом, Буркит-ов лимфом, рак на дебелото црево и воспалителни болести37,38.Дополнително, некои вируси го таргетираат BRD4 за регулирање на вирусната и клеточната транскрипција, како што се папиломавирус, ХИВ и SARS-CoV-236,39.
За да ја мапираме интеракцијата BRD4 користејќи PDPL, го комбиниравме miniSOG со кратка N- или C-терминална изоформа на BRD4.Протеомските резултати открија висок степен на преклопување помеѓу двете конструкции (Дополнителна слика 9а).Нуклеарниот протеом идентификуван со miniSOG-H2B покрива 77,6% од протеините во интеракција со BRD4 (Дополнителна слика 9б).Потоа, се користеа различни времиња на осветлување (2, 5, 10, 20 мин) за прилагодување на радиусот на маркерот (сл. 4а и дополнителни податоци 3).Заклучуваме дека при пократки фотопериоди, PDPL првенствено ќе ги означува партнерите за директно врзување, додека подолгите периоди ќе вклучуваат протеини идентификувани за време на пократки периоди на фотоактивирање, како и индиректни цели во комплексите за означување.Всушност, најдовме силно преклопување помеѓу соседните временски точки (84,6% за 2 и 5 мин; 87,7% за 5 и 10 мин; 98,7% за 10 и 20 мин) (сл. 4б и дополнителна слика 9в).Во сите експериментални групи, најдовме не само самообележување на BRD4, туку и неколку познати цели како што се MED1, CHD8, BICRA, NIPBL, SMC1A и HMGB1 забележани во базата на податоци за стрингови.Јонската јачина на овие цели е пропорционална со времето на експозиција (сл. 4в и дополнителна слика 9г).GO анализата на протеините идентификувани во 2-минутната група покажа дека идентификуваните протеини се локализирани во јадрото и се вклучени во ремоделирање на хроматин и функцијата на РНК полимеразата.Молекуларната функција на протеинот беше збогатена со врзување на хроматин или транскрипциона коактивација, во согласност со функцијата BRD4 (сл. 4г).Анализата на протеинска интеракција овозможена со стринг база на податоци откри прво ниво на индиректни интеракции помеѓу BRD4 и HDAC интерактивни комплекси како што се SIN3A, NCOR2, BCOR и SAP130 (сл. 4e и дополнителна слика 9e), во согласност со BRD4 и HDAC врзувачки ацетилирани хистони ..Дополнително, репрезентативните цели идентификувани со LC-MS/MS, вклучувајќи ги Sin3A, NSUN2, Fus и SFPQ, беа потврдени со Western blotting (сл. 4f).Неодамна, беше пријавено дека кратката изоформа на BRD4 формира јадра со својства на сепарација на течно-течна фаза (LLPS).Протеините за врзување на РНК Fus и SFPQ посредуваат во LLPS на различни клеточни процеси и овде се идентификувани како неевидентирани BRD4 врзувачки протеини.Интеракцијата помеѓу BRD4 и SFPQ беше потврдена со експерименти со ко-имунопреципитација (ко-IP) (слика 4г), што укажува на друг механизам за раздвојување на течно-течна фаза со посредство на BRD4 што заслужува понатамошно истражување.Земени заедно, овие резултати сугерираат дека PDPL е идеална платформа за идентификација на познати BRD4 интеракции, како и непознати врзувачки протеини.
Шематски приказ на означување на близина на BRD4 со посредство на miniSOG, времиња на експозиција: 2, 5, 10 и 20 мин.б Преклопување на протеините идентификувани во различни времиња на осветлување.Збогатувањето на протеините идентификувано во HEK293T-miniSOG-BRD4 беше статистички значајно во споредба со дивиот тип HEK293T.c Интензитетот на јоните кога се квантифицираат неозначените репрезентативни познати протеини кои се врзуваат за BRD4 за време на одреденото време на изложеност.n = 3 биолошки независни примероци.Податоците се претставени како средна вредност ± стандардна девијација.г Генска онтолошка анализа (GO) на протеините идентификувани во 2-минутната група.Наведени се првите десет GO термини.Меурчињата се обоени според категоријата GO термин, а големината на меурчињата е пропорционална на бројот на протеини пронајдени во секој термин.д Анализа на низи на протеини во интеракција со BRD4.Жолтите кругови се директен лепак, а сивите кругови се првиот слој на индиректен лепак.Црвените линии ги претставуваат експериментално одредените интеракции, а сините линии ги претставуваат предвидените интеракции.f Репрезентативните врзувачки цели за BRD4 идентификувани во LC-MS/MS беа потврдени со вестерн blotting.g Експериментите со ко-имунопреципитација ја потврдуваат интеракцијата помеѓу SFPQ и BRD4.Овие експерименти беа независно повторени најмалку двапати со слични резултати.Необработените податоци се обезбедуваат во форма на датотеки со необработени податоци.
Покрај идентификацијата на нерегистрирани цели поврзани со POI, претпоставуваме дека PDPL ќе биде погоден за идентификување на супстрати за ензими, што би барало карактеризација на индиректните врзувачки протеини во големи комплекси за да се наведат нерегистрирани супстрати.Паркин (кодиран од PARK2) е Е3 лигаза и познато е дека мутациите во паркинот предизвикуваат автосомно рецесивна јувенилна Паркинсонова болест (AR-JP)42.Покрај тоа, паркинот е опишан како суштински за митофагија (митохондријална автофагија) и отстранување на реактивните видови кислород.Сепак, иако се идентификувани неколку супстрати на паркинот, улогата на паркинот во оваа болест останува нејасна.За да се наведат неговите некарактеризирани супстрати, PDPL беше тестиран со додавање miniSOG на N- или C-крајот на паркинот.Клетките беа третирани со карбонил цијанид протонски транспортер m-хлорофенилхидразон (CCCP) за да се активира паркинот преку патеката PINK1-Parkin.Во споредба со нашите резултати од BRD4 PDPL, фузијата на паркинот N-терминал откри поголем сет на целни протеини, иако покриваше поголем дел од C-крајот (177 од 210) (Слика 5а, б и дополнителни податоци 4).резултатот е конзистентен со извештаите дека N-терминалните ознаки може неправилно да го активираат Parkin44.Изненадувачки, имаше само 18 преклопувачки протеини во нашите податоци со објавени резултати од AP-MS за Parkin43, најверојатно поради разликите помеѓу клеточните линии и работните текови на протеомика.Покрај четирите познати протеини (ARDM1, HSPA8, PSMD14 и PSMC3) идентификувани со два методи (сл. 5в)43.За понатамошно потврдување на резултатите од LC-MS/MS, третман со PDPL и последователно Western blotting беа користени за да се споредат резултатите од анализата на матичните клетки HEK293T и стабилната N-терминална паркин линија.Претходно непознатите цели CDK2, DUT, CTBP1 и PSMC4 беа тестирани со познато врзивно средство, DNAJB1 (сл. 5d).
Вулкански заплет на протеини во интеракција со паркин во HEK293T клетки со стабилно изразен miniSOG споен со N- или C-крајот на паркинот (n = 3 независни биолошки експерименти).На вулкански парцели се користеше студентски т-тест со две опашки.Како негативна контрола се користеше HEK293T. Значително променетите протеини се означени со црвено (p <0,05 и >2 пати разлика во интензитетот на јоните). Значително променетите протеини се означени со црвено (p <0,05 и >2 пати разлика во интензитетот на јоните). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и >2-кратна разница во интензивности ионов). Значително изменетите протеини се означени со црвено (p <0,05 и >2 пати разлика во интензитетот на јоните).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05 和> 2 倍离子强度差异）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратна разница во јоној силе). Значително изменетите протеини се означени со црвено (p <0,05 и > 2-кратна разлика во јонската јачина).Поврзани протеини важни за HEK293T-miniSOG, но не важни за HEK293T се прикажани со зелена боја.б Венов дијаграм кој покажува преклопувачки протеини помеѓу N-терминалните и C-терминалните конструкции.N-терминалните ознаки може неправилно да го активираат паркинот и да резултираат со повеќе препознатливи протеини.в Венов дијаграм кој покажува преклопувачки протеини помеѓу PDPL и AP-MS.Наведени се познати интерактори, вклучувајќи 4 од 18 протеини кои се преклопуваат и 11 од 159 протеини конкретно идентификувани во PDPL.г Репрезентативните цели идентификувани со LC-MS/MS беа потврдени со Western blotting.e Ssu72 и SNW1 беа идентификувани како нерегистрирани паркин подлоги.Овие протеински плазмиди означени со FLAG беа трансфектирани во HEK293T и HEK293T-Parkin-miniSOG проследено со третман со CCCP во различни временски точки.Деградацијата беше поизразена кај Паркин линијата на прекумерна експресија.f Користејќи го протеазомскиот инхибитор MG132, беше потврдено дека процесот на деградација на Ssu72 и SNW1 е посредуван од протеазом-убиквитинација.Овие експерименти беа независно повторени најмалку двапати со слични резултати.Необработените податоци се обезбедуваат во форма на датотеки со необработени податоци.
Имено, протеините идентификувани со PDPL мора да вклучуваат протеини кои се врзуваат за паркин и нивните супстрати.За да откриеме нерегистрирани супстрати на паркин, избравме седум идентификувани протеини (PUF60, PSPC1, UCHL3, PPP1R8, CACYBP, Ssu72 и SNW1) и трансфициравме плазмиди за да ги изложиме овие гени на нормален HEK293T и стабилно да го изразат miniSOG-Parkin's CPCC9 третман, проследен со HEK2.Нивоата на протеините Ssu72 и SNW1 беа значително намалени во стабилната линија miniSOG-Parkin (сл. 5e).Третманот со CCCP за 12 часа резултираше со најзначајна деградација на двата супстрати.За да се испита дали разградувањето на Ssu72 и SNW1 е регулирано со протеазом-убиквитинација, протеазомскиот инхибитор MG132 беше додаден за да ја инхибира активноста на протеазомот, а всушност откривме дека нивниот процес на деградација е инхибиран (сл. 5f).Дополнителни цели без супстрати беа потврдени како интерактори на Паркин со употреба на вестерн blotting (Дополнителна слика 10), што покажа конзистентни резултати со LC-MS/MS.Како заклучок, интеграцијата на работниот тек на PDPL со верификацијата на трансфекција на целниот протеин овозможува идентификација на нерегистрирани супстрати на E3 лигаза.
Развивме заедничка платформа за означување на близина која ви овозможува да ги идентификувате точките на интерес во просторот и времето.Платформата се базира на протеинот miniSOG фотосензибитор, кој е само околу 12 kDa, помалку од половина од големината на зрелиот ензим APEX2 (27 kDa) и една третина од големината на TurboID (35 kDa).Помалата големина треба во голема мера да го прошири опсегот на апликации за проучување на мали протеински интерактоми.Потребно е дополнително истражување на дополнителни фотосензибилизатори, без разлика дали се генетски кодирани протеини или мали молекули, за да се зголеми квантниот принос на единечен кислород и да се прошири чувствителноста на овој пристап.За тековната верзија на miniSOG, може да се постигне висока временска резолуција со користење на сино осветлување за да се активираат маркерите за близина.Дополнително, подолгото време на експозиција ослободи поголем „облак“ од единечен кислород, што резултираше со модификација на повеќе дистални остатоци од хистидин, зголемен радиус на означување и способност за фино прилагодување на просторната резолуција PDPL.Исто така, тестиравме седум хемиски сонди за да го зголемиме односот сигнал-позадина и го истраживме молекуларниот механизам зад овој пристап.Работниот тек на TOP-ABPP во комбинација со непристрасно отворено пребарување потврди дека модификациите се случиле само кај хистидините и дека не е забележана конзистентна микросредина за зголемени модификации на хистидин, освен за умерена предност за хистидините во регионот на јамката.
PDPL, исто така, се користи за карактеризирање на субклеточни протеоми со специфичност и покриеност на протеомот барем споредливи со други методи за означување на близина и хемиски методи на специфични органели.Маркерите за близина се исто така успешно користени за карактеризирање на површинските, лизозомалните и протеомите поврзани со секретомот46,47.Ние веруваме дека PDPL ќе биде компатибилен со овие субклеточни органели.Дополнително, го предизвикавме PDPL со идентификување цели за врзување со цитосолен протеин кои се посложени од мембранските врзани протеини поради нивните динамички својства и вклученост во повеќе временски интеракции.PDPL беше применет на два протеини, транскрипциониот коактиватор BRD4 и лигазата поврзана со болеста Е3 Паркин.Овие два протеини беа избрани не само поради нивните основни биолошки функции, туку и поради нивната клиничка важност и терапевтски потенцијал.За овие две POI, беа идентификувани добро познати обврзувачки партнери, како и нерегистрирани цели.Имено, протеинот SFPQ поврзан со одвојување на фази беше потврден со co-IP, што може да укаже на нов механизам со кој BRD4 (кратката изоформа) го регулира LLPS.Во исто време, веруваме дека идентификацијата на подлогите на Паркин е сценарио во кое е потребна идентификација на индиректни лепила.Идентификувавме два неидентификувани супстрати на паркин и ја потврдивме нивната деградација по патеката убиквитинација-протеазом.Неодамна, развиена е стратегија за фаќање базирана на механизми за откривање на хидролазни супстрати со нивно заробување со ензими.Иако ова е многу моќен метод, тој не е погоден за анализа на супстрати вклучени во формирањето на големи комплекси и бара формирање на ковалентни врски помеѓу ензимот и супстратот.Очекуваме дека PDPL може да се прошири за проучување на други протеински комплекси и ензимски семејства, како што се семејствата деубиквитиназа и металопротеаза.
Развиена е нова форма на miniSOG, наречена SOPP3, со подобрено производство на единечен кислород.Го споредивме miniSOG со SOPP3 и најдовме подобрени перформанси за обележување, иако односот сигнал-шум остана непроменет (Дополнителна слика 11).Претпоставивме дека оптимизацијата на SOPP3 (на пр., преку насочена еволуција) ќе доведе до поефикасни протеини за фотосензибилизација кои бараат пократко време на светлина и на тој начин ќе овозможат да се фатат подинамични клеточни процеси.Имено, сегашната верзија на PDPL е ограничена на клеточната средина бидејќи бара сино осветлување и не може да навлезе во длабоките ткива.Оваа карактеристика ја исклучува неговата употреба во студиите за модели на животни.Сепак, комбинацијата на оптогенетиката со PDPL може да обезбеди можност за истражување на животни, особено во мозокот.Дополнително, други конструирани инфрацрвени фотосензибилизатори исто така го отстрануваат ова ограничување.Во моментов се водат истражувања во оваа област.
Клеточната линија HEK293T е добиена од ATCC (CRL-3216).Клеточната линија беше негативна за инфекција со микоплазма и беше култивирана во DMEM (Thermo, #C11995500BT) дополнет со 10% фетален говедски серум (FBS, Vistech, #SE100-B) и 1% пеницилин/стрептомицин (Hyclone, #SV30010).израснат во.
3-аминофенилен (примерок 3) и (4-етинилфенил)метанамин (примерок 4) се купени од Bidepharm.Пропиламинот (сонда 2) е купен од Energy-chemicals.N-(2-Аминофенил)пент-4-инамид (сонда 1) е синтетизиран според објавените методи.
Дополнителната табела 1 ги наведува генетските конструкции користени во оваа студија.Секвенците miniSOG и KillerRed беа клонирани од подарок плазмид од P. Zou (Универзитет во Пекинг).Секвенцата за таргетирање на митохондријалната матрица беше изведена од 23 N-терминални амино киселини на COX4 и клонирани во наведените вектори со помош на склоп на Гибсон (Beyotime, #D7010S).За таргетирање на мембраната и јадрото на ендоплазматскиот ретикулум, SEC61B човечка ДНК (NM_006808.3) (NEB, #M0491L) засилена со PCR од cDNA библиотека на HEK293T клетки и H2B ДНК (донирана од D. Lin, Shenzhen Bay Laboratory) и клонирани, како што е споменато погоре.Освен ако не е поинаку назначено, другите протеински гени кои се користат за трансфекција и изградба на стабилни клеточни линии беа засилени со PCR од клеточната cDNA библиотека HEK293T.G3S (GGGS) и G4S (GGGGS) беа користени како поврзувачи помеѓу протеинот на мамката и miniSOG.V5 епитоп ознака (GKPIPNPLLGLDST) беше додадена на овие фузиони конструкции.За изразување кај цицачите и за воспоставување стабилна клеточна линија, конструкцијата на фузија на miniSOG беше субклонирана во лентивирусниот вектор pLX304.За бактериска експресија, miniSOG беше клониран во векторот pET21a означен како 6xHis на C-крајот.
Клетките HEK293T беа засеани со 2,0 x 105 клетки по бунар во чинии со шест бунари и трансфектирани 24 часа подоцна со рекомбинантни лентивирусни плазмиди (2,4 μg pLX304) и плазмиди за пакување на вируси (1,5 μg psPAX2 и 1,2 μg psPAX2 и 1,2 μg psPAX2 и 1,2 μg psPAX2 и 1,2 μg00, време со 0Bepo2). , #C0533), околу 80% фузија.По трансфекција преку ноќ, медиумот беше променет и инкубиран уште 24 часа.Собирањето на вирусот е извршено по 24, 48 и 72 часа.Пред инфекцијата на целните клеточни линии, вирусниот медиум беше филтриран преку филтер од 0,8 μm (Merck, #millex-GP) и полибрен (Solarbio, #H8761) беше додаден до концентрација од 8 μg/ml.По 24 часа, на клетките им беше дозволено да се опорават со промена на медиумот.Клетките беа избрани со користење на 5 μg/ml бластицидин (Solarbio, #3513-03-9) за првите три пасуси како понизок строг избор.Потоа се користи 20 μg/ml како построг режим за следните три пасуси.
Клетките беа засеани во комори со 12 бунари (Ibidi, #81201) со густина од приближно 20.000 клетки по бунар.За да се подобри адхезијата на клетките HEK293T, додадете 50 µg/ml фибронектин (Corning, #356008) разреден во физиолошки раствор со фосфат пуфер (PBS, Sangon, #B640435) на 37°C.Коморите беа претходно третирани 1 час, а потоа отстранети со PBS.По 24 часа, клетките беа измиени еднаш со PBS, инкубирани со 1 mM сонда 3 во свеж балансиран раствор на Хенксова сол (HBSS, Gibco, #14025092) 1 час на 37°C, а потоа инкубирани со сина LED (460 nm ).) беа озрачени 10 мин на собна температура.После тоа, клетките беа измиени двапати со PBS и фиксирани со 4% формалдехид во PBS (Sangon, #E672002) 15 минути на собна температура.Вишокот формалдехид беше отстранет од фиксираните ќелии со миење три пати со PBS.Клетките потоа беа пропустливи со 0,5% Triton X-100 (Sangon, #A600198) во PBS и измиени 3 пати со PBS.Потоа отстранете ја комората и додадете во секој примерок 25 µl од реакционата смеса за кликнување што содржи 50 µM Cy3-азид (Aladdin, #C196720), 2 mM CuSO4 (Sangon, #A603008), 1 mM BTTAA (Confluore, #BDJ-4) и 0,5 mg/ml натриум аскорбат (Aladdin, бр. S105024) и се инкубираат 30 минути на собна температура.По брза реакција, клетките беа измиени шест пати со PBS што содржи 0,05% Tween-20 (Sangon, #A600560) (PBST) и потоа блокирани со 5% BSA (Abcone, #B24726) во PBST 30 минути на собна температура.
За имунобоење со колокализација, клетките се инкубираат со примарни антитела според наведените услови: анти-V5 ознака mAb на глувчето (1:500, CST, #80076), зајачко анти-Hsp60 mAb (1:1000), ABclonal, #A0564), зајачко поликлонално анти-калнексинско антитело (1:500, Abcam, #ab22595) или зајачко анти-ламин A/C моноклонално антитело (1:500; CST, #2032) на 4 °C преку ноќ.По 3 пати миење со PBST, клетките беа инкубирани со секундарни антитела: козјо анти-зајак Алекса флуор 488 (Термо, #A11034) разреден 1:1000, алекса флуор против коза против глушец 594 (CST, #8889) разреден 1:10.разредување Се разредува на собна температура 30 минути.Клетките потоа беа измиени 3 пати со PBST и контра-обоени со DAPI (Thermo, #D1306) во PBS 10 минути на собна температура.По 3 миења со PBS, клетките беа запечатени во 50% глицерол (Sangon, #A600232) во PBS за сликање.Имунофлуоресцентните слики се добиени со помош на конфокален микроскоп ZEISS LSM 900 Airyscan2 и софтвер ZNE 3.5.
За единечно флуоресцентно сликање со кислород, клетките беа измиени двапати со Hanks HEPES пуфер пред да се додадат 100 nM Si-DMA во Hanks HEPES пуфер (DOJINDO, #MT05).По изложување на светлина, клетките се инкубираат во CO2 инкубатор на 37°C за 45 минути.Клетките потоа беа измиени двапати со Hanks-овиот HEPES пуфер и контра-обоени со Hoechst во Hanks-овиот HEPES пуфер 10 минути на собна температура и визуелизирани со помош на конфокален микроскоп ZEISS LSM 900., #M36008) во HBSS пуфер кој содржи калциум и магнезиум.По изложување на светлина или доксорубицин (MCE, #HY-15142A), клетките беа инкубирани во CO2 инкубатор на 37° C. 10 минути, измиени двапати со HBSS пуфер и инкубирани со Hoechst во HBSS пуфер на собна температура.минути.Доксорубицин беше користен како позитивна контрола на сонда каде што клетките беа третирани со 20 μM доксорубицин во HBSS што содржи 1% BSA за 30 мин.Имунофлуоресцентните слики се добиени со помош на конфокален микроскоп Zeiss LSM 900.
Клетките HEK293T кои стабилно изразуваат мито-miniSOG беа засеани со густина од приближно 30% во садови од 15 cm.По 48 часа, кога беше постигнато ~ 80% слив, клетките беа измиени еднаш со PBS, инкубирани со 1 mM сонда 3 во свеж HBSS пуфер во 1 час на 37°C и потоа осветлени со сина LED 10 минути во просторијата. температура..Потоа, клетките беа измиени двапати со PBS, изгребани и повторно суспендирани во ладен PBS пуфер кој содржи инхибитори на протеаза без EDTA (MCE, #HY-K0011).Клетките беа лизирани со сонично на врвот за 1 минута (1 секунда вклучено и 1 секунда исклучено со 35% амплитуда).Добиената смеса беше центрифугирана на 15,871 xg 10 мин на 4°C за да се отстранат остатоците, а концентрацијата на супернатантот беше прилагодена на 4 mg/mL со користење на комплет за анализа на протеини BCA (Beyotime, #P0009).Комбинирајте 1 ml од горенаведениот лизат со 0,1 mM фоторазградлив биотин азид (Confluore, #BBBD-14), 1 mM TCEP (Sangon, #A600974), 0,1 mM TBTA лиганд (Aladdin, #T162437) и 1 mM SO4 incub ротирање нагоре 1 час на собна температура.По брза реакција, додадете ја смесата во претходно измешаниот раствор (MeOH:CHCl3:H2O = 4 ml:1 ml:3 ml) во стаклена вијала од 10 ml.Примероците беа измешани и центрифугирани на 4500 g 10 минути на собна температура.Долниот и горниот раствор беа фрлени, талогот беше измиен двапати со 1 ml метанол и центрифугиран на 15871 × g за 5 минути на 4 ° C.Додадете 1 ml 8 M уреа (Aladdin, бр. U111902) во 25 mM амониум бикарбонат (ABC, Aladdin, бр. A110539) за да се раствори талогот.Примероците беа реконституирани со 10 mM дитиотреитол (Sangon, #A100281 во 25 mM ABC) 40 минути на 55°C проследено со додавање на 15 mM свеж јодоацетамид (Sangon, #A600539) на собна температура во мрак.Алкилација во рок од 30 минути..Дополнителни 5 mM дитиотреитол беа додадени за да се запре реакцијата.Подгответе приближно 100 µl зрна од агароза на NeutrAvidin (Thermo, #29202) за секој примерок со миење 3 пати со 1 ml PBS.Горенаведениот раствор на протеом беше разреден со 5 ml PBS и инкубиран со претходно измиени зрнца на NeutrAvidin агароза 4 часа на собна температура.Зрната потоа беа измиени 3 пати со 5 ml PBS што содржи 0,2% SDS (Sangon, #A600485), 3 пати со 5 ml PBS што содржи 1M уреа и 3 пати со 5 ml ddH2O.Зрната потоа беа собрани со центрифугирање и повторно суспендирани во 200 μl од 25 mM ABC што содржи 1 M уреа, 1 mM CaCl2 (Macklin, #C805228) и 20 ng/μl трипсин (Promega, #V5280).Трипсинизирајте преку ноќ на 37°C со ротација.Реакцијата беше прекината со додавање на мравја киселина (Термо, # A117-50) додека pH не достигне 2-3.Зрната беа измиени 3 пати со 1 ml PBS што содржи 0,2% SDS, 3 пати со 1 ml PBS што содржи 1 M уреа, а потоа 3 пати со 1 ml дестилирана вода.Модифицираните пептиди беа ослободени со светлосна лиза (365 nm) за 90 мин користејќи 200 μl 70% MeOH.По центрифугирањето, супернатантот беше собран.Зрната потоа беа измиени еднаш со 100 μl 70% MeOH и супернатантите беа споени.Примероците се сушат во вакуумски концентратор Speedvac и се чуваат на -20°C до анализа.
За да се идентификуваат и квантифицираат пептидите модифицирани со единечен кислород, примероците беа повторно растворени во 0,1% мравја киселина и 1 μg пептиди беа анализирани со помош на масен спектрометар Orbitrap Fusion Lumos Tribrid опремен со нано ESI извор од Tune и Xcalibur од софтверот на продавачот 4.3.Примероците беа одвоени на 75 µm × 15 cm внатрешно спакувана капиларна колона со 3 µm C18 материјал (ReproSil-pur, #r13.b9.) и беа поврзани со EASY-nLC 1200 UHPLC систем (Thermo).Пептидите беа одвоени со линеарна градиентна хроматографија од 95 минути од 8% растворувач Б до 50% растворувач Б (А = 0,1% мравја киселина во вода, B = 0,1% мравја киселина во 80% ацетонитрил), потоа линеарно се зголеми на 98% Б мин. за 6 мин со проток од 300 nl/min.Orbitrap Fusion Lumos собира податоци наизменично помеѓу целосно MS скенирање и MS2 скенирање во зависност од податоците.Напонот на прскање беше поставен на 2,1 kV, а температурата на капиларот за транспорт на јони беше 320 ° C.MS спектрите (350-2000 m/z) беа собрани со резолуција од 120.000, AGC 4 × 105 и максимално време на внесување од 150 ms.10-те најчести повеќекратно наелектризирани прекурсори во секое целосно скенирање беа фрагментирани со користење на HCD со нормализирана енергија на судир од 30%, прозорец за изолација на четирипол од 1,6 m/z и поставка за резолуција од 30.000.Целна AGC за тандемска масена спектрометрија користејќи 5×104 и максимално време на внесување 150 ms.Динамичниот исклучок е поставен на 30 секунди. Неназначените јони или оние со полнење од 1+ и >7+ беа одбиени за MS/MS. Неназначените јони или оние со полнење од 1+ и >7+ беа одбиени за MS/MS. Неназначенные ионы или ионы со зарядом 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Неназначените јони или јони со полнење од 1+ и >7+ беа отфрлени за MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS. Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Неодредени јони или јони со полнежи од 1+ и >7+ беа отфрлени за MS/MS.
Необработените податоци се обработуваат со помош на компјутерската платформа FragPipe базирана на MSFragger.Масовните предрасуди и соодветните амино киселини беа одредени со користење на алгоритам за отворено пребарување со толеранција на маса на претходник од -150 до 500 Da.Потоа беа идентификувани модифицираните пептиди со помош на модификации на хистидин со масивни добивки од +229,0964 и +247,1069 Da во PD (Proteome Discoverer 2.5, Thermo).
Клетките кои стабилно го изразуваат споениот miniSOG ген беа поставени во чинии од 6 cm.По постигнување на ~ 80% слив, клетките беа измиени еднаш со HBSS (Gibco, #14025092), потоа инкубирани со хемиски сонди во HBSS 1 час на 37°C и осветлени со сина светлина.10W LED 20 минути на собна температура.За да се утврди кој тип на реактивни кислородни видови се вклучени во PDPL, 0,5 mM витамин Ц (MCE, #HY-B0166), 5 mM Trolox (MCE, #HY-101445), D2O (Sigma, #7789-20-0) 100 mM манитол (Energy Chemical, #69-65-8), 100 μM H2O2, 10 mM NaN3 беа додадени во клетките како додатоци.По миењето со ладен PBS, клетките беа стружени, собрани во цевчиња со центрифуга од 1,5 ml и сониција со врв 1 минута во 200 μl PBS со 1x инхибитор на протеаза без EDTA (1 s и 1 s без, амплитуда 35%).Добиената смеса беше центрифугирана на 15,871 × g за 10 минути на 4 °C и концентрацијата на супернатантот беше прилагодена на 1 mg/mL со користење на комплет за анализа на протеини BCA.Приближно 50 µl од горенаведениот лизат беше инкубиран со 0,1 mM родамин азид (Aladdin, бр. T131368), 1 mM TCEP, 0,1 mM TBTA лиганд и 1 mM CuSO4 1 час на собна температура со ротација од дното кон врвот.По реакцијата на кликнување, таложењето со ацетон беше извршено со додавање на 250 μl претходно изладен ацетон на примероците, инкубирање на -20°C за 20 мин и центрифугирање на 6010 × g за 10 минути на 4 °C.Соберете го пелетот и варете го во 50 µl 1x Laemmli's пуфер 10 минути на 95 °C.Примероците потоа беа анализирани на долги гелови SDS-PAGE и визуелизирани со помош на системот за сликање Bio-rad ChemiDoc MP Touch со софтверот Image Lab Touch.
Изразувањето и прочистувањето на рекомбинантниот miniSOG-6xHis протеин беше извршено како што беше претходно опишано.Накратко, клетките на E. coli BL21(DE3) (TransGen, #CD701-02) беа трансформирани со pET21a-miniSOG-6xHis и протеинската експресија беше индуцирана со 0,5 mM IPTG (Sangon, #A600168).По лизата на клетките, протеините беа прочистени со помош на зрнца на Ni-NTA агароза (MCE, бр. 70666), дијализирани против PBS и складирани на -80°C.
За ин витро анализа на близина на етикетата базирана на антитела, измешајте 100 μM прочистен miniSOG, 1 mM сонда 3 и 1 μg анти-етикета моноклонално антитело на глушец (TransGen, #HT501-01) во PBS до вкупен волумен на реакција од 50 μl..Реакционата смеса беше озрачена со сина LED светлина 0, 2, 5, 10 и 20 мин на собна температура.Смесата беше инкубирана со 0,1 mM биотин-PEG3-азид (Aladdin, #B122225), 1 mM TCEP, 0,1 mM TBTA лиганд и 1 mM CuSO4 за 1 час на собна температура на шејкер со движење нагоре.По брза реакција, додадете 4 пати Laemmli's пуфер директно во смесата и варете на 95°C 10 мин.Примероците беа анализирани на SDS-PAGE гелови и анализирани со вестерн blotting со стрептавидин-HRP (1:1000, Solarbio, #SE068).
Синтетички пептид што содржи хистидин со C-терминална амидација (LHDALDAK-CONH2) беше користен за да се анализира означувањето ин витро базирано на пептид во близина.Во оваа анализа, 100 μM прочистен miniSOG, 10 mM сонда 3 и 2 μg/ml синтетички пептид беа измешани во PBS во вкупен волумен на реакција од 50 μl.Реакционата смеса беше озрачена со сина LED светлина 1 час на собна температура.Еден микролитар примерок беше анализиран со помош на систем LC-MS (Waters, SYNAPT XS Ions Mobility Time-of-Flight масен спектрометар со софтвер за анализа на спектарот MassLynx).
Клетките HEK293T кои стабилно го изразуваат генот за фузија на miniSOG беа засеани во садови од 10 cm за линии со различна локализација на органели (Mito, ER, Nucleus) и садови од 15 cm за линиите Parkin-miniSOG и BRD4-miniSOG.По постигнување на ~ 90% слив, клетките беа измиени еднаш со HBSS, потоа инкубирани со сонда 3 во HBSS 1 час на 37°C и осветлени со 10 W сина LED на собна температура.За бесконтактно означување на Паркин, 10 µM протон карбонил цијанид носач m-хлорофенилхидразон CCCP (Solarbio, #C6700) со сонда 3 во HBSS беше додаден 1 час на 37°C.Чекорите на лиза на клетките, кликање, редукција и алкилација беа исти како што е опишано погоре, освен што беа додадени 2 mg лизат и биотин PEG3 азид беше користен во реакцијата на кликнување наместо фоторазградлив биотин азид.По збогатувањето, зрната беа измиени 3 пати со 5 ml PBS што содржи 0,2% SDS, 3 пати со 5 ml PBS што содржи 1 M уреа и 3 пати со 5 ml PBS.Потоа, 2 µg трипсин се додадени на 300 µl 25 mM ABC што содржи 1 M уреа за да се расцепи протеинот преку ноќ на 37°C.Реакцијата беше прекината со додавање на мравја киселина додека не се постигне pH вредност од 2-3.По трипсинизацијата на монистра, пептидниот раствор беше десолен со помош на SOLAµ HRP колона (Thermo, #60209-001) и се исуши во вакуумски концентратор Speedvac.Пептидите беа повторно растворени во 0,1% мравја киселина и 500 ng пептиди беа анализирани со помош на масен спектрометар Orbitrap Fusion Lumos Tribrid опремен со изворот нано-ESI опишан погоре.Пептидите беа одвоени на комерцијални RP-HPLC предколони (75 μm x 2 cm) (Thermo, бр. 164946) и аналитички RP-HPLC колони (75 μm x 25 cm) (Термо, бр. 164941), и двете исполнети со 2 μm.градиент од 8% до 35% ACN за 60 минути, а потоа линеарно се зголеми на 98% B за 6 минути со брзина на проток од 300 Nl/min.MS спектрите (350-1500 m/z) беа собрани со резолуција од 60.000, AGC 4 × 105 и максимално време на внесување од 50 ms.Избраните јони беа последователно фрагментирани со HCD во 3 s циклуси со нормализирана енергија на судир од 30%, прозорец за изолација на четирипол од 1,6 m/z и резолуција од 15000. Тандемски масен спектрометар AGC цел од 5 × 104 и максимално време на инјектирање користени се од 22 ms.Динамичкото исклучување е поставено на 45 секунди. Неназначените јони или оние со полнење од 1+ и >7+ беа одбиени за MS/MS. Неназначените јони или оние со полнење од 1+ и >7+ беа одбиени за MS/MS. Неназначенные ионы или ионы со зарядом 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Неназначените јони или јони со полнење од 1+ и >7+ беа отфрлени за MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS. Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Неодредени јони или јони со полнежи од 1+ и >7+ беа отфрлени за MS/MS.
Чекорите за подготовка на примерокот до збогатувањето на зрната на NeutrAvidin беа исти како во LC-MS/MS анализата опишана погоре.Приближно 50 μg лизат беа искористени како влез за контрола на вчитување и 2 mg лизат беа искористени за реакции на кликнување.По збогатувањето и миењето со неутравидин, врзаните протеини беа елуирани со додавање на 50 μl од Laemmli-овиот пуфер во зрната од агарозната смола и вриење на 95°C 5 минути.Влезот на контролното оптоварување и примероците збогатени со монистра беа анализирани со SDS-PAGE и пренесени во PVDF мембрани (Milipore, #ISEQ00010) со стандардни методи Western blot.Мембраните беа блокирани со 5% обезмастено млеко (Sangon, #A600669) во TBS што содржи 0,1% tween-20 (TBST) и се инкубираат последователно со примарни и секундарни антитела.Примарните антитела беа разредени 1:1000 во 5% обезмастено млеко во TBST и инкубирани преку ноќ на 4°C.Секундарните антитела се користени во сооднос 1:5000 и се инкубираат 1 час на собна температура.Мембраните беа визуелизирани со хемилуминисценција користејќи го системот за сликање Chemidoc MP.Сите несечени скенови на дамки и гелови на сликата се претставени како необработени податоци.
Примарните антитела користени во оваа студија вклучуваат зајачко анти-SFPQ моноклонално антитело (CST, бр. 71992), зајачко анти-FUS моноклонално антитело (CST, бр. 67840), зајачко анти-NSUN2 поликлонално антитело (Proteintech, бр. 20854-1- АП), поликлонално антитело зајак против mSin3A (Abcam, #ab3479), моноклонално антитело против ознака на глушец (TransGen, #HT201-02), моноклонално антитело против β-актин од глушец (TransGen, #HC201-01), зајачко анти -CDK2 моноклонално антитело (ABклонално, #A0094), зајачко моноклонално антитело кон CTBP1 (ABклонално, #A11600), поликлонално антитело на зајакот кон DUT (ABclonal, #A2901), поликлонално антитело на зајакот кон PSMC4 (ABclonal, #A2505), DNAJB1 поликлонално антитело (ABclonal, # A5504).Овие антитела се користени на разредување 1:1000 во 5% обезмастено млеко во TBST.Секундарните антитела користени во оваа студија вклучуваа анти-зајачки IgG (TransGen, #HS101-01), IgG против глушец (TransGen, #HS201-01) на разредување 1:5000.
За понатамошно испитување дали BRD4 има интеракција со SFPQ, стабилните HEK293T и BRD4-miniSOG ќелиите кои прекумерно го изразуваат HEK293T беа поставени во чинии од 10 cm.Клетките беа измиени со ладен PBS и лизирани во 1 ml Pierce IP пуфер за лиза (Thermo Fisher, #87787) со инхибитор на протеаза без EDTA 30 минути на 4°C.После тоа, лизатите беа собрани во цевчиња за центрифугирање од 1,5 ml и центрифугирани на 15,871 xg за 10 минути на 4°C.Супернатантот беше собран и инкубиран со 5 μg анти-V5 означено моноклонално антитело на глувчето (CST, #80076) преку ноќ на 4°C.Измијте приближно 50 µl протеински A/G магнетни зрна (MCE, #HY-K0202) двапати со PBS што содржи 0,5% Tween-20.Потоа клеточните лизати беа инкубирани со магнетни зрна 4 часа на 4°C со ротација од дното кон врвот.Потоа зрната беа измиени четири пати со 1 ml PBST пуфер и се варат на 95°C 5 мин.Примероците беа анализирани на SDS-PAGE гелови и пренесени во PVDF мембрани користејќи стандардни методи Western blot.Мембраните беа блокирани во 5% обезмастено млеко во TBST и се инкубираат последователно со примарни и секундарни антитела.Примарни антитела Rabbit анти-SFPQ моноклонални антитела (CST, #71992) се користеа во сооднос од 1:1000 во 5% обезмастено млеко во TBST и инкубирани преку ноќ на 4°C.Анти-зајачки IgG се користеше во сооднос 1:5000 и се инкубираше 1 час на собна температура.Мембраните беа визуелизирани со хемилуминисценција користејќи го системот за сликање Chemidoc MP.
Сите структури користени за анализата на површината за пристап до растворувач (SASA) се добиени од Protein Data Bank (PDB)52 или од базата на податоци за структурата на протеини AlphaFold53.Апсолутна SASA беше пресметана за секој остаток користејќи ја програмата FreeSASA.Само целосни и недвосмислени податоци на SASA за означениот хистидин и неговите соседи беа користени за да се добие просечната SASA за секоја структура.Релативната пристапност на растворувач (RSA) за секој хистидин беше пресметана со делење на апсолутната вредност на SASA со емпириската максимална можна површина на остатоци достапна за растворувачот.Сите хистидини потоа беа класифицирани како скриени ако просечната RSA беше под 20%, инаку изложени56.
Необработените датотеки добиени во режимот DDA беа пребарувани со помош на Proteome Discoverer (v2.5) или MSfragger (Fragpipe v15.0) во соодветната база на податоци за протеински проверени SwissProt што содржи вообичаени загадувачи.Пептидите бараа целосен трипсин со две места на расцепување кои недостасуваат, метилација на карбамоил како фиксна модификација и оксидација на метионин како динамична модификација.Толеранциите на тежината на претходниците и фрагментите беа поставени на 10 ppm и 0,02 Da (MS2 Orbitrap), соодветно. Ударите на загадувачите беа отстранети, а протеините беа филтрирани за да се добие лажна стапка на откривање од <1%. Ударите на загадувачите беа отстранети, а протеините беа филтрирани за да се добие лажна стапка на откривање од <1%. Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы, чтобы получить коэффициент ложного обнаружения <1%. Ударите на загадувачите беа отстранети и протеините се филтрираа за да дадат стапка на лажна детекција од <1%.去除污染物命中，过滤蛋白质以获得<1%的错误发现率。 <1%的错误发现率。 Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы для достижения уровня ложных обнаружений <1%. Ударите на загадувачите беа отстранети и протеините се филтрираа за да се постигне лажно позитивна стапка од <1%.За квантитативна анализа без употреба на етикети, користена е нормализирана содржина на протеини од три биолошки повторувања.Анализата на субклеточната локализација на протеините беше изведена со помош на анализа на Gene Ontology (GO) од DAVID Bioinformatics Resources, MitoCarta 3.0 и бази на податоци составени и објавени од групата Alice Ting.Картата на вулканот е добиена од Персеј (v1.6.15.0). Промените во изобилството на протеини беа тестирани за статистичка значајност со користење на двостран t-тест, а протеинските хитови беа идентификувани со промена на изобилството >2 (освен ако не е поинаку наведено) и p вредност <0,05. Промените во изобилството на протеини беа тестирани за статистичка значајност со користење на двостран t-тест, а протеинските хитови беа идентификувани со промена на изобилството >2 (освен ако не е поинаку наведено) и p вредност <0,05. Изменения кратности содержания белка были проверены на статистическую значимость со использованием двустороннего t-критерия, и совпадения белков были идентифицированы изменением содержания> 2 (если не е значајно) Промените во преклопот на содржината на протеините беа тестирани за статистичка значајност со користење на двостран т-тест, а протеинските совпаѓања беа идентификувани со промена на содржината >2 (освен ако не е поинаку наведено) и ап вредност <0,05.使用 双边 t 检验 测试 蛋白质 丰度 倍数 变化 的 统计 显着性 并 并 蛋白质 命 中 的 丰度 变化> 2 （除非 另 有） 和 P 值 <0,05。使用 双边 t 检验 测试 蛋白质 倍 数 变化 的 统计 显着性 并 蛋白质 命 中 的 变化 变化> 2 （另 有 说明 和 和 P 值 <0,05。 Статистическую значимость кратных изменений содержания белка проверяли со использованием двустороннего t-критерия, а совпадения белков определијали для изменений содержания >2 (если не указано иноей <0, и p. Статистичката значајност на преклопните промени во содржината на протеини беше тестирана со користење на дво-опашки т-тест, а протеинските совпаѓања беа одредени за промени во содржината >2 (освен ако не е поинаку назначено) и p-вредности <0,05.Анализата на интеракцијата на протеините беше изведена со користење на GO анализа заедно со базата на податоци String.
Беа спроведени три биолошки реплики со слични резултати.Статистичката анализа беше направена со GraphPad Prism (софтвер GraphPad) и вулкански парцели беа генерирани со Perseus (v1.6.15.0).За да се споредат двете групи, p-вредностите беа одредени со помош на студентски t-тест со две опашки.Само единечни протеини идентификувани најмалку двапати во експерименталната група беа вклучени во вулканските парцели, а соодветните вредности што недостасуваа во контролната група беа заменети со Персеус од нормална дистрибуција за да може да се пресмета p-вредноста.Лентите за грешка ја претставуваат средната вредност ± стандардна девијација.Во протеомските анализи за статистичка анализа, изобилството на протеини што се појавија во најмалку две биолошки реплики беше задржано.Не беа користени статистички методи за претходно одредување на големината на примерокот.Експериментите не се случајни.Истражувачите не беа слепи за задачите за време на експериментот и евалуацијата на резултатите.
За повеќе информации за дизајнот на студијата, видете го апстрактот на извештајот за истражување на природата поврзан со овој напис.
Податоците за масената спектрометрија добиени во оваа студија беа доставени до Конзорциумот ProteomeXchange преку партнерското складиште iProX57 под ID на податоци PXD034811 (PDPL-MS база на податоци).Необработените податоци се обезбедуваат во форма на датотеки со необработени податоци.Оваа статија ги дава оригиналните податоци.
Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Запознавање на соседството: користење биотинилација зависна од близина за карактеризирање на протеински комплекси и мапирање на органели. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Запознавање на соседството: користење биотинилација зависна од близина за карактеризирање на протеински комплекси и мапирање на органели.Gingras, AS, Abe, KT и Raut, B. Запознавање со околината: користење на биотинилација зависна од близина за карактеризирање на протеински комплекси и мапирање на органели. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. 了解邻里：使用邻近依赖性生物素化来表征蛋白质复合物徶叶 Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Разбирање на соседството: искористете ја зависноста на соседството од биолошкиот живот.Gingras, AS, Abe, KT и Raut, B. Разбирање на близината: карактеризација на протеински комплекси и мапирање на органели користејќи биотинилација зависна од близина.Тековно.Мое мислење.Хемиски.биологија 48, 44-54 (2019).
Гери, Ј.Б. и сор.Мапирање на микросредината со пренесување на енергијата на Декстер во имуните клетки.Science 367, 1091-1097 (2020).
Хертлинг, ЕЛ и сор.Мрежите со скала со два протеоми откриваат клеточно-специфично ремоделирање на човечкиот интерактом.Cells 184, 3022-3040.e3028 (2021).