Вести

Ви благодариме што ја посетивте Nature.com.Верзијата на прелистувачот што ја користите има ограничена поддршка за CSS.За најдобро искуство, препорачуваме да користите ажуриран прелистувач (или да го оневозможите режимот на компатибилност во Internet Explorer).Во меѓувреме, за да обезбедиме континуирана поддршка, ќе ја направиме страницата без стилови и JavaScript.
Клетките на ракот еволуирале различни механизми за да го надминат клеточниот стрес и да продолжат да напредуваат.Протеинската киназа R (PKR) и неговиот протеински активатор (PACT) се почетните одговорни кои следат различни стрес сигнали што доведуваат до инхибиција на клеточната пролиферација и апоптоза.Сепак, регулацијата на патеката PACT-PKR во клетките на ракот останува во голема мера непозната.Овде, откривме дека долгата некодирачка RNA (lncRNA) аспартил tRNA синтетаза антисенс РНК 1 (DARS-AS1) е директно вклучена во инхибицијата на патеката PACT-PKR и промовира пролиферација на клетките на ракот.Користејќи голем функционален скрининг на lncRNA поврзана со ракот CRISPri 971, откривме дека DARS-AS1 е поврзан со значително зголемена пролиферација на канцерогени клетки.Затоа, нокаутот DARS-AS1 ја инхибира клеточната пролиферација и ја промовира апоптозата на канцерогените клетки во различни клеточни линии на рак in vitro и значително го намалува растот на туморот in vivo.Механички, DARS-AS1 директно се врзува за доменот за активирање PACT и ја спречува интеракцијата PACT-PKR, а со тоа ја намалува активацијата на PKR, фосфорилацијата eIF2α и ја инхибира апоптотичната клеточна смрт.Клинички, DARS-AS1 е широко изразен кај повеќе видови на рак, а прекумерната експресија на оваа lncRNA е показател за лоша прогноза.Оваа студија ја разјаснува специфичната регулација на ракот на патеката PACT-PKR со DARS-AS1 lncRNA и обезбедува друга цел за прогноза и третман на ракот.
Способноста да се приспособат на стресот е важна карактеристика на опстанокот и пролиферацијата на клетките на ракот.Брзата пролиферација и метаболичките знаци на ракот го достигнуваат врвот во суровите микросредини - лишување од хранливи материи, хипоксија и ниска pH вредност - што може да предизвика сигнални патишта за смрт на клетката.Дисрегулацијата на гените чувствителни на стрес како што се p535, протеините од топлински шок 6, 7, KRAS8, 9 и HIF-110, 11, 12, 13 често се забележува кај ракот, со што се блокира апоптозата и се промовира преживувањето.
Протеинската киназа R (PKR) е важен сензор за стрес и подединица киназа на еукариотскиот иницијативен фактор 2α (eIF2α), транслациски регулатор кој го поврзува клеточниот стрес со клеточната смрт.PKR првично беше идентификуван како антивирусен протеин со детекција на туѓа двоверижна РНК (dsRNA).По активирањето, PKR фосфорилира eIF2α за да ја инхибира синтезата на вирусни и клеточни протеини14,15,16.PACT (PKR активаторски протеин) е идентификуван како прв PKR активатор протеин во отсуство на dsRNA17,18,19,20,21,22,23.Преку директна интеракција со PKR, PACT трансдуцира различни стресови (серумски глад, третман со пероксид или арсенит) до PKR и низводните сигнални патишта.Покрај eIF2α фосфорилацијата, активирањето на PKR со посредство на PACT предизвикува различни настани поврзани со одговорот на стрес, вклучително и изменет статус на редокс преку патеката PI3K/Akt24, подобрена проверка на оштетувањето на ДНК преку p5325,26 и NF-κB27,28 ја регулира транскрипцијата, 29. Со оглед на нивната критична улога во одговорот на стресот, пролиферацијата, апоптозата и другите клучни клеточни процеси, PKR и PACT се ветувачки терапевтски цели за многу болести, особено ракот30,31,32,33.Сепак, и покрај ова плеиотропно функционално и биолошко значење, регулирањето на активноста на PACT/PKR во клетките на ракот останува неостварливо.
lncRNAs се транскрипти поголеми од 200 нуклеотиди без потенцијал за кодирање на протеини.Бидејќи најсовремените проекти за секвенционирање на целиот геном идентификуваа илјадници lncRNA, 35,36 беа направени многу напори за да се разјаснат нивните биолошки функции.Сè поголем број истражувања покажаа дека lncRNAs се вклучени во многу биолошки процеси37 вклучувајќи го регулирањето на инактивацијата на Х-хромозомот38,39, втиснувањето40, транскрипцијата41,42, транслацијата43, па дури и растот на ракот44,45,46,47.Овие студии објавија дека многу lncRNA се вклучени во патеката PACT/PKR.Една таква студија покажа дека lncRNA ASPACT ја инхибира транскрипцијата на PACT и го зголеми нуклеарното задржување на PACT mRNA.Други студии покажаа дека lncRNA nc886 се врзува за PKR и ја инхибира неговата фосфорилација49,50.Досега, lncRNA што ја регулира PACT-посредуваната PKR активирање не е пријавена.
Аспартил-tRNA синтетаза антисенс РНК 1 (DARS-AS1) е идентификувана како онкогена lncRNA51,52,53,54.Преку регулацијата на miP-194-5p53, miP-12952 и miP-532-3p51, DARS-AS1 се покажа дека го промовира растот на чисто клеточен карцином на бубрежни клетки, карцином на тироидната жлезда и неситноклеточен карцином на белите дробови, соодветно.Тонг и неговите колеги, исто така, открија дека DARS-AS1 промовира прогресија на миелом преку одржување на стабилноста на мотивот за врзување на РНК протеинот 39 (RBM39).Сепак, не се спроведени студии за тоа дали оваа lncRNA е вклучена во регулирањето на активирањето на PACT-PKR и одговорот на стресот на клетките на ракот.
Овде, изведовме екран за губење на функцијата во големи размери користејќи го системот CRISPri и утврдивме дека DARS-AS1 lncRNA промовира пролиферација на неколку видови на канцерогени клетки.Дополнително, идентификувавме главен механизам: DARS-AS1 директно се врзува за PACT, го инхибира врзувањето PACT и PKR, спречува фосфорилација на eIF2α, понизок PKR супстрат, и на крајот ја инхибира апоптотичната клеточна смрт.Како заклучок, нашата работа ја открива DARS-AS1 lncRNA како регулатор на патеката PACT-PKR и потенцијална цел за третман и прогноза на ракот.
Екстензивните студии за геномско профилирање идентификуваа стотици lncRNA поврзани со рак.Сепак, нивната функција останува во голема мера непозната56.За да ги идентификуваме надежните кандидати за lncRNA вклучени во прогресијата на ракот, извршивме скрин за губење на функцијата за намалена пролиферација во клеточната линија на колоректален карцином SW620 користејќи го системот CRISPRi (сл. 1а).Уникатната карактеристика на клеточните линии на рак на дебелото црево SW480 и SW620 е тоа што тие се добиени од примарни и секундарни тумори кај еден пациент.Ова обезбедува вредна споредба за проучување на генетските промени во прогресијата на напреднат рак на дебелото црево.Затоа, ги анализиравме транскриптомите на клеточните линии на колоректален карцином (SW480 и SW620) користејќи секвенционирање на РНК и собравме некои потенцијални функционални lncRNA од објавената литература.Врз основа на овие резултати, дизајниравме здружена sgRNA библиотека која содржи 7355 sgRNA олиго кои таргетираат 971 lncRNA поврзани со рак и 500 нетаргетирани sgRNA олиго за негативна контрола (Дополнителни податоци 1).
Шематски приказ на скрининг со помош на системот CRISPRi.b sgRNA збогатување по скрининг.Хоризонталната испрекината линија претставува log2 (промена на пати) = ±0,58.Вертикалната линија со точки означува p вредност = 0,05.Црните точки претставуваат нецелна sgRNA (означена како NC).Црвените точки се sgRNA насочени кон DARS-AS1.Сините точки се sgRNA насочени кон LINC00205, претходно опишана онкогена lncRNA.промена на превиткување = (нормализирано читање, ден 17)/(нормализирано читање, ден 0).c Намалувањето на DARS-AS1 sgRNA го инхибирало клеточниот раст.Лентите за грешка претставуваат ± стандардна девијација на трите експерименти.* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01 студентски t-тест со две опашки.г DARS-AS1 изразување во тумори (TCGA база на податоци).em Изразување на DARS-AS1 во спарени нормални и туморски примероци од пациенти со BLCA, KIRC, PRAD, LUSC, UCEC, LUAD, LIHC, KIRP и COAD, соодветно (TCGA база на податоци).p-вредностите се добиени со помош на спарен студентски т-тест со две опашки.
По конструирањето на плазмидот и пакувањето на лентивирусот, ја трансдуциравме клеточната линија на колоректален карцином dCas9-SW620 со горната библиотека во четири независни експерименти со инфекција.Мноштвото на инфекции (МОИ) за овие инфекции беше 0,1-0,3, што покажува дека секоја клетка може да се трансфицира само со една sgRNA.По 18 дена ин витро култура, профилот на збогатување на целните sgRNA се намали или се зголеми по скринингот, додека бројот на нетаргетирани контролни олигонуклеотиди остана релативно непроменет во споредба со профилот пред скрининг, што покажува дека нашата цел има високо специфичен екран библиотека.Ориз.1б и дополнителна табела 1). LINC00205, за кој претходно беше објавено дека промовира рак на белите дробови и прогресија на рак на црниот дроб58,59,60, беше скриниран (log2 (промена на преклоп) < -0,58, p вредност <0,05), потврдувајќи ја веродостојноста на овој скрининг (сл. 1б). LINC00205, за кој претходно беше објавено дека промовира рак на белите дробови и прогресија на рак на црниот дроб58,59,60, беше скриниран (log2 (промена на преклоп) < -0,58, p вредност <0,05), потврдувајќи ја веродостојноста на овој скрининг (сл. 1б). LINC00205, о котором ранее сообщалось, што он способствует прогрессированию надежна рака легких и рака печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, верност 5 значајност p <0, 1б). LINC00205, претходно пријавен за промовирање на прогресијата на ракот на белите дробови и ракот на црниот дроб58,59,60, беше исклучен (log2 (промена на пати) <-0,58, p-вредност <0,05), потврдувајќи ја робусноста на овој скрининг (сл. .1б) . LINC00205 之前被报道可促进肺癌和肝癌进展58,59,60，被筛选掉（log2（倍数变化）< -0.58，p 值< 0.05），证实了该筛选的可靠性（图1b）。 LINC00205 之前被报道可促进肺癌和肝癌进展58,59,60，被筛选掉（log2（倍数变化）< -0.58，p 值< 0.05），证实了该筛选的可靠性（图1b）。 LINC00205, о котором ранее сообщалось, што он способствует прогрессированию надежта за рака легких и печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, p-значението, 1б). LINC00205, претходно пријавен дека промовира прогресија на рак на белите дробови и црниот дроб58,59,60, беше исклучен (log2 (промена на пати) <-0,58, p-вредност <0,05), потврдувајќи ја робусноста на овој скрининг (сл. .1б).
Помеѓу сите тестирани lncRNA, DARS-AS1 исто така беше скриниран, при што трите сродни sgRNA олигонуклеотиди значително се намалија по 18 дена од културата, што сугерира дека падот на оваа lncRNA резултираше со намалена пролиферација на ракот (сл. 1б).Овој резултат беше дополнително поддржан од анализата на МТС во клетките на колоректалниот канцер, која покажува дека стапката на раст на ДАРС-АС1-клетките со нокдаун е само преполовена во споредба со контролните клетки (слика 1в) и е конзистентна со претходните извештаи за неколку други типови на рак.: бистроклеточен карцином на бубрег, рак на тироидната жлезда и неситноклеточен карцином на белите дробови51,52,53,55.Сепак, неговата функција и молекуларни механизми кај колоректалниот карцином остануваат неистражени.Затоа, ја избравме оваа lncRNA за понатамошно проучување.
За да го проучиме изразот на DARS-AS1 кај пациенти, сеопфатно анализиравме 10.327 примероци на тумор од проектот Cancer Genome Atlas (TCGA).Нашите резултати покажуваат дека DARS-AS1 е широко изразен и значително регулиран во здравите клетки во различни тумори, вклучително и аденокарцином на дебелото црево (COAD), бубрежен чист клеточен карцином (KIRC) и карцином на бубрежни папиларни клетки (KIRP)..Многу малку (сл. 1г и дополнителна слика 1а, б). Анализата на спарени здрави/туморски примероци дополнително потврди значително повисока експресија на DARS-AS1 во туморите на уротелниот карцином на мочниот меур (BLCA), бубрежниот чист клеточен карцином (KIRC), аденокарцином на простата (PRAD), белодробен сквамозен карцином (LUSC) , ендометријален карцином на корпус на матката (UCEC), аденокарцином на белите дробови (LUAD), хепатоцелуларен карцином на црниот дроб (LIHC), карцином на бубрежни папиларни клетки (KIRP) и аденокарцином на дебелото црево (COAD) (p вредност < 0,05) (сл. 1e-m) . Анализата на спарени здрави/туморски примероци дополнително потврди значително повисока експресија на DARS-AS1 во туморите на уротелниот карцином на мочниот меур (BLCA), бубрежниот чист клеточен карцином (KIRC), аденокарцином на простата (PRAD), белодробен сквамозен карцином (LUSC) , ендометријален карцином на корпус на матката (UCEC), аденокарцином на белите дробови (LUAD), хепатоцелуларен карцином на црниот дроб (LIHC), карцином на бубрежни папиларни клетки (KIRP) и аденокарцином на дебелото црево (COAD) (p вредност < 0,05) (сл. 1e-m) .Анализата на спарени здрави/туморски примероци, исто така, потврди значително повисока експресија на DARS-AS1 кај уротелниот карцином на мочниот меур (BLCA), карцином на бубрежни и бубрежни клетки (KIRC), аденокарцином на простата (PRAD), тумори на сквамозен карцином на белите дробови (LUSC)., карцинома ендометрия тела матки (UCEC), аденокарцинома легкого (LUAD), гепатоцеллюлярная карцинома печени (LIHC), папиллярно-клеточна карцинома почки (KIRP) и аденокарцинома толстой, м) . , ендометријален карцином на корпус утери (UCEC), аденокарцином на белите дробови (LUAD), хепатоцелуларен карцином на црниот дроб (LIHC), карцином на папиларни клетки на бубрезите (KIRP) и аденокарцином на дебелото црево (COAD) (p вредност < 0,05) (сл. 1e– m) .配对 健康/肿瘤样本 的 分析 证实 了 了 dars-as1 在 尿路 上 皮癌 皮癌 (blca) 、 肾 肾 透明 细胞癌 (KIRC) 、 前列 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 (prad) 、 肺鳞状 细胞癌 (lusc) 肿瘤 中 中 的显着 更 表达 ， 子宫体子宫 内膜 癌 （（ucec） ， 肺腺癌 （luad） ， 细胞癌 （lihc） ， 肾 肾 细胞癌 （kirp） 和结肠腺癌 （coad） p 值<0,05) (图1e-m) .配 对 健康/肿瘤样本 的 分析 了 了 dars-os1 在 尿路 上 皮癌 皮癌 皮癌 、 肾 肾 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 前列 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 、 、 细胞癌 细胞癌)癌 (kirp) (coad) (p 值<0,05) (图1e-m) .Анализата на здрави/туморски спарени примероци дополнително ја поддржа улогата на DARS-AS1 кај уротелниот карцином на мочниот меур (BLCA), карцином на бубрежни клетки (KIRC), аденокарцином на простата (PRAD) и тумори на сквамозен карцином на белите дробови (LUSC).экспресия при карциноме тела матки (UCEC), аденокарциноме легкого (LUAD), гепатоцеллюлярной карциноме (LIHC), почечно-почечной папиллярно-клеточной карциноме (KIRP) и аденокарциноме толкого (ЛУАД) -m). изразување во карцином на корпус матка (UCEC), белодробен аденокарцином (LUAD), хепатоцелуларен карцином (LIHC), карцином на бубрежни папиларни клетки (KIRP) и аденокарцином на дебелото црево (COAD) (p вредност <0,05) (Слика 1e -m).Земени заедно, овие резултати покажуваат дека DARS-AS1 е широко и високо изразен кај различни видови на рак.
Бидејќи DARS-AS1 и DARS (генот што ја кодира антисензната нишка) го делат истиот промотор и се наоѓаат еден до друг, ние дизајниравме shRNA за конкретно да го собори DARS-AS1, но не и DARS (Дополнителна слика 2а,б и дополнителна табела 2 ) .Покрај SW620, користевме и три други клеточни линии кои високо изразуваат DARS-AS1 за да ја проучуваме ефикасноста и функцијата на соборувањето на shRNA (Дополнителна табела 3).Нашите резултати покажаа дека сите три развиени shRNA постигнале најмалку 80% DARS-AS1 ефикасност на соборување со мал ефект врз количината на DARS mRNA (Дополнителна слика 2c-f).Дополнително, откривме дека DARS-AS1 нокдаун со овие shRNAs значително го инхибира клеточниот раст во клеточните линии на колоректален карцином SW620 (49,7%) и HCT116 (27,7%), клеточна линија на рак на дојка MBA-MD-231 (53,4%).) и клеточната линија на хепатом HepG2 (92,7% намалување), како и нивната способност да формираат неприцврстени сфери (просечно намалување од ~ 50,8%, 44,6%, 40,7% и 75,7% по клеточна линија) (сл. 2а,б).Во SW620, резултатите од анализата за формирање колонии дополнително потврдија дека DARS-AS1 shRNA значително ја инхибира клеточната пролиферација со просечно намалување од приближно 69,6% (сл. 2в).
Ефект на контролната shRNA и DARS-AS1 shRNA на клеточната пролиферација (а) и формирањето на сфероиди (б) во клетките SW620, HCT116, MBA-MD-231 и HepG2.в Ефект на контролната shRNA и DARS-AS1 shRNA на формирање на колонии во клетките SW620.Клеточна пролиферација (г), формирање на сфероиди (д) и формирање на колонии (ѓ) на клетките SW620 кои прекумерно изразуваат DARS-AS1.Прикажаните податоци се средна ± стандардна девијација од три експерименти.* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01 и *** p ≤ 0,001 со двостран студентски t-тест.
За да ги надополниме студиите за губење на функцијата, потоа создадовме ќелии SW620 кои прекумерно изразуваат DARS-AS1 (Дополнителна слика 2g).Прекумерното изразување на DARS-AS1 значително го зголеми клеточниот раст (1,8 пати), формирањето на незакотвени сфероиди (1,4 пати) и формирањето на колонии (3,3 пати) во клетките SW620 (сл. 2d-f).Го потврдивме овој резултат користејќи друга клеточна линија што изразува DARS-AS1, A549.Оваа засилена клеточна пролиферација поради прекумерна експресија на DARS-AS1 беше дополнително забележана во клетките A549 (Дополнителна слика 2h, i и дополнителна табела 3).Земени заедно, овие студии за добивка и загуба покажуваат дека DARS-AS1 промовира пролиферација на клетките на ракот ин витро.
За да го истражиме основниот механизам со кој DARS-AS1 ја регулира клеточната пролиферација, извршивме анализа на влечење на РНК за да ги идентификуваме неговите потенцијални партнери кои се врзуваат за протеините.Резултатите од RT-qPCR покажаа дека околу 86,2% од DARS-AS1 се наоѓа во цитоплазмата на клетките SW620 (Дополнителна слика 3а).Ин витро транскрибираниот биотинилиран DARS-AS1 или псевдоРНК потоа беше инкубиран со клеточни лизати SW620 проследени со SDS-PAGE сепарација.Последователното боење со сребро покажа дека посебна лента (~ 38 kDa) е значително збогатена во примероците за влечење DARS-AS1, но не и во примероците за лажна РНК или монистра (сл. 3а).Оваа лента беше идентификувана како PKR активирачки протеин (PACT) со масена спектрометрија (MS) и дополнително потврдена со имуноблотирање во клеточните линии SW620, HCT116 и HepG2 (сл. 3а,б).Збогатувањето на DARS и сродните PACT протеини - PKR и TRBP - исто така беше испитано со користење на RNA анализа со Western blotting (WB).Резултатите покажаа дека не е пронајдена директна интеракција помеѓу DARS-AS1 RNA и овие три протеини (Дополнителна слика 3б).Специфичната интеракција помеѓу DARS-AS1 и PACT беше дополнително потврдена со анализа на РНК имунопреципитација (RIP), која покажа дека DARS-AS1 е значително збогатен со анти-PACT антитела, но не и со други контролни РНК (Слика 3в).За да се утврди дали DARS-AS1 директно комуницира со PACT во отсуство на други клеточни компоненти, беше изведена ин витро анализа на интерферометрија на бислој (BLI) со користење на прочистен PACT.DARS-AS1 означена со биотин или лажна РНК беше имобилизирана на биосензори за стрептавидин (SA), а потоа инкубирана во кинетички пуфер кој содржи 1 μM PACT.Имено, PACT силно се врзува за DARS-AS1 (вредност на KD ~ 26,9 nM), но не и за имитација на РНК (Слика 3г).Земени заедно, овие резултати покажуваат директна интеракција и висок афинитет помеѓу DARS-AS1 и PACT.
Анализата на влечење на РНК идентификуваше дека DARS-AS1 комуницира со PACT во клетките SW620.Погоре, сребрено боење на сродни протеини.Беа направени пониски имуноблоци со анти-PACT антитела.б РНК влечната анализа беше изведена во клетките HCT116 (горе) и HepG2 (долу).Збогатувањето на PACT беше откриено со имуноблотирање.Анализите за имунопреципитација на cRNA (RIP) беа изведени во клетките SW620 со користење на наведените антитела.г Кривите на врзување PACT за DARS-AS1 со целосна должина или контролна РНК се добиени со помош на интерферометрија на бислој (BLI).РНК беше имобилизирана на биосензор на стрептавидин.За мерење на асоцијацијата се користеше 1 μM PACT.д. Анализата за повлекување на РНК беше изведена со употреба на биотинилиран DARS-AS1 со целосна должина или скратен (горе).Имуноблот покажува дека е примен PACT (долу).ѓ Прочистениот означен PACT беше инкубиран со биотинилиран DARS-AS1 со целосна должина или скратен (како во e) за in vitro RIP анализа.Извлечената РНК беше потврдена со RT-qPCR.g Релативниот афинитет на различни фрагменти на РНК за PACT е добиен со користење на интерферометрија на бислој.За анализа, користени се 100 nM RNA и 1 μM RAST.h In vitro RIP анализите беа изведени со користење на прочистен недопрен или скратен означен PACT.Извлечената РНК беше потврдена со RT-qPCR.i Стапка на раст на клетките SW620 кои прекумерно изразуваат DARS-AS1, PACT или и двете.j Прекумерното изразување на целосен или скратен DARS-AS1 во клетките SW620 имаше различни ефекти врз клеточниот раст.k Апоптозата беше откриена со имуноблотирање со анти-PARP антитела.l Нокаут на DARS-AS1 индуцира апоптоза на клетките SW620 како што е прикажано со цитометрија на проток.Прикажаните податоци се средна ± стандардна девијација од три експерименти. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001, со студентски t тест со две опашки. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001, со студентски t тест со две опашки. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 од студентски т-тест со две опашки. *p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 од студентски т-тест со две опашки.
Потоа генериравме три биотинилирани DARS-AS1 РНК фрагменти со ин витро транскрипција за да го идентификуваме регионот DARS-AS1 потребен за PACT асоцијација (слика 3e).Резултатите од анализата на РНК покажаа дека секој фрагмент може да комуницира со PACT, но 3'-терминалниот регион (384-768 нуклеотиди означени со А3) покажа повеќе од 1-384 нуклеотиди означени со А1) (сл. 3д).Слични резултати беа забележани во in vitro RIP анализата со користење на рекомбинантен PACT (Слика 3f).Во согласност со овие резултати, експериментите за поврзување на имобилизираните фрагменти на РНК со PACT со помош на BLI, исто така, покажаа дека PACT има повисок афинитет за A3 (384-768 nt) (вредност на KD од приближно 94,6 nM), додека речиси и да нема врски со други области.(сл. 3г).
Ги испитавме и поврзаните обврзувачки региони во PACT.PACT содржи три функционални домени, од кои два се конзервирани двоверижни домени за врзување на РНК (dsRBD) и трет домен (означен D3) кој делува како активатор на протеинските интеракции.За да го испитаме капацитетот за врзување на lncRNA на секој домен, конструиравме три мутации кои го отстранија секој од трите домени и извршивме ин витро RIP анализа.Нашите резултати покажаа дека бришењето на третиот домен (D3) на PACT значително ја намали неговата интеракција со DARS-AS1 (за 0,11 пати во споредба со недопрениот PACT) во споредба со другите две мутации (сл. 3h), се покажа дека ослободувањето на D3 во интеракција со DARS.-AC1.Земени заедно, овие резултати сугерираат дека интеракцијата помеѓу DARS-AS1 и PACT може да се случи првенствено преку 3' крајот на DARS-AS1 и доменот D3 на PACT.
Забележавме дека DARS-AS1 немаше ефект врз изразувањето на PACT и PACT немаше ефект врз DARS-AS1 (Дополнителна слика 3в).Потоа го испитавме ефектот на PACT нокдаун врз растот на клетките.За разлика од DARS-AS1, релативните клетки растеа 1,5-3 пати побрзо кога PACT беше соборен (Дополнителна слика 3d).Резултатите од анализата за формирање на колонии покажаа дека клетките формирале 2-3-кратни колонии по третман со shRNA со PACT (Дополнителна слика 3e).За да тестираме дали DARS-AS1 ја регулира клеточната пролиферација преку PACT, генериравме SW620 клетки кои прекумерно изразуваат PACT, DARS-AS1 или и двете.Прекумерната експресија на PACT покажа значајна инхибиција на клеточната пролиферација (Слика 3i).Додека прекумерната експресија на DARS-AS1 сама по себе значително ја промовираше клеточната пролиферација, немаше значајна разлика во стапката на раст на клетките кои прекумерно изразуваат DARS-AS1 и PACT.Овие резултати сугерираат дека PACT може да се спротивстави на зголемената пролиферација предизвикана од прекумерната експресија на DARS-AS1.
Бидејќи различните региони на DARS-AS1 имаат различни способности за врзување на PACT, го испитавме нивното релативно влијание врз клеточната пролиферација со различна прекумерна експресија на фрагментите на DARS-AS1.Во споредба со другите два фрагменти, DARS-AS1 беше прекумерно изразен на 3' крајот (384-768 nt), главниот регион поврзан со PACT во DARS-AS1, кој имаше највисока способност да стимулира клеточна пролиферација (сл. 3j).Овие резултати укажуваат на позитивна корелација помеѓу врзувачкиот капацитет и биолошката функција на DARS-AS1.
Пријавено е дека PACT е про-апоптотички протеин19.Затоа, го истражувавме ефектот на DARS-AS1 врз апоптозата.Како што се очекуваше, соборувањето на DARS-AS1 значително го зголеми расцепувањето на PARP во SW620 клетките и го зголеми процентот на анексин V-позитивни клетки во клеточните линии SW620, HCT116, HepG2 и MBA-MD-231 (сл. 3k).3).3f–h), што покажува дека антиапоптотичниот ефект на DARS-AS1 во клетките на ракот е спротивен на функцијата на PACT за поттикнување апоптоза.Земени заедно, овие резултати сугерираат дека механизмот на онкогената функција на DARS-AS1 може да биде преку инхибиција на функцијата PACT.
Следно, ги истражувавме функционалните импликации на асоцијацијата DARS-AS1-PACT.Пријавено е дека PACT го активира PKR преку директна интеракција, што последователно ја подобрува фосфорилацијата на eIF2α, предизвикувајќи транслациона бришење и апоптоза17.Прво, испитавме дали DARS-AS1 влијае на клеточната локализација на PACT и PKR.Конфокалната флуоресцентна микроскопија покажа дека PACT и PKR се високо колокализирани во клетките SW620 со просечен коефициент на корелација на Пирсон од 0,72.Во меѓувреме, прекумерната експресија на DARS-AS1 значително ја намали колокализацијата на PACT и PKR (просечен коефициент на корелација на Пирсон 0,61) (Слика 4а).За да истражиме дали DARS-AS1 може да ја модулира интеракцијата PACT-PKR, извршивме анализа на ко-имунопреципитација (ко-IP) со анти-PACT антитела во клеточните лизати SW620.PKR беше високо збогатен со анти-PACT во контролните клетки, додека обновувањето на PKR беше значително намалено во лизатите од клетките кои прекумерно изразуваат DARS-AS1 (сл. 4б).Прочистените означени PACT и PKR беа користени за ин витро анализи за врзување на протеините.Според тоа, оние што обезбедија DARS-AS1, но без контролна РНК, покажаа потисната интеракција PACT-PKR (Слика 4в).Сите резултати покажаа дека DARS-AS1 ја наруши комуникацијата PACT и PKR.
забележана е колокализација на PACT и PKR во контролните клетки или клетки кои прекумерно го изразуваат DARS-AS1 со помош на конфокална флуоресцентна микроскопија.Јадрата беа обоени со DAPI.Статистичките резултати се добиени од 16 фотографии.б Ко-имунопреципитација (ко-ИП) со користење на анти-PACT антитела во клеточни лизати на контролните SW620 клетки или клетки кои прекумерно изразуваат DARS-AS1.c Обележан PACT, прочистен PKR и транскрибиран in vitro со DARS-AS1 или лажна РНК беа инкубирани за in vitro анализа на врзувањето на протеините.За имунопреципитација беа користени антитела против знамето.d Имуноблоти со наведените антитела беа изведени во клетките SW620 и HCT116 трансфектирани со контролна shRNA или DARS-AS1-shRNA проследено со серумско гладување.Нивото на изразување на DARS-AS1 ја промени клеточната чувствителност на тапсигаргин.Клетките SW620 беа трансфицирани со DARS-AS1 shRNA, DARS-AS1 плазмид со прекумерна експресија или контролен плазмид.Клетките беа третирани со тапсигаргин 48 часа и одржливоста на клетките беше одредена со помош на реагенсот МТС.ѓ Ин витро транскрибиран DARS-AS1 или лажна РНК и прочистен PACT беа користени за ин витро анализа на активација и детекција на имуноблот.g Имуноблотите со користење на овие антитела беа изведени на SW620-ctrl клетки (лево) или клетки кои прекумерно изразуваат PKR мутанти (десно).Овие клетки потоа беа трансфектирани со контролна shRNA или DARS-AS1-shRNA проследено со серумско гладување.h Проточната цитометрија покажа дека инактивацијата на мутантот PKR ја компензира апоптозата индуцирана од DARS-AS1 во клетките SW620.Во клетките SW620 (лево) или HCT116 (десно) беа направени имуноблоти со наведените антитела.Клетките трансфектирани со контролна shRNA или DARS-AS1 shRNA се лишени од серум и се дополнети со 100 nM PKR C16 инхибитор или DMSO.Лента за скала = 5 µm.Прикажаните податоци се средна ± стандардна девијација од три експерименти.* p ≤ 0,05 студентски t-тест со две опашки.
Генерално се верува дека штом PACT ќе комуницира со PKR17, може да се индуцира PKR фосфорилација на Thr451.Нашите резултати укажаа дека нивото на PKR фосфорилација беше значително покачено во DARS-AS1 нокдаун клетките по серумскиот глад (сл. 4г и дополнителна слика 4а).Соодветно, откривме дека фосфорилацијата на eIF2α, главниот PKR супстрат, исто така беше значително зголемена со DARS-AS1 shRNA (сл. 4г и дополнителна слика 4а).Тапсигаргин е стрес-стесор на ЕР што предизвикува ЕР да ослободува Ca2+.Објавено е дека третманот со тапсигаргин предизвикува изразување и активирање на PACT, кој дополнително комуницира со и го активира PKR, што доведува до апоптоза со зголемување на eIF2α фосфорилацијата 18,61.Овде, го користевме тапсигаргинот како стимулатор на патеката PACT/PKR за да истражиме дали DARS-AS1 може да им помогне на клетките да го надминат стресот со инхибиција на патеката PACT/PKR.Забележавме дека нивото на изразување DARS-AS1 позитивно корелираше со клеточната отпорност на тапсигаргин.Клетките SW620 кои прекумерно изразуваа DARS-AS1 преживеаја подобро кога беа третирани со тапсигаргин, додека клетките со соборување на DARS-AS1 станаа поподложни (сл. 4д).Во согласност со овие резултати, прекумерната експресија на DARS-AS1 ја намали фосфорилацијата на PKR индуцирана од тапсигаргин (Дополнителна слика 4б).Спротивно на тоа, по третманот со тапсигаргин, PKR и eIF2α беа фосфорилирани во поголема мера во DARS-AS1 соборувачките клетки во споредба со контролните клетки (Дополнителна слика 4б).Интересно, тапсигаргинот индуцираше DARS-AS1 изразување на начин зависен од дозата, што може да укаже на анти-стрес функција на DARS-AS1 (Дополнителна слика 4в).Дополнително, извршивме ин витро анализи за активирање за да ги потврдиме овие набљудувања.Накратко, PKR беше прочистен од клеточни лизати со користење на анти-PKR антитело, потоа инкубиран со рекомбинантен PACT и DARS-AS1 транскрибиран in vitro.По ензимската реакција, фосфо-PKR беше откриен со помош на WB.Нашите резултати покажаа дека PKR фосфорилацијата беше значително инхибирана од DARS-AS1, но не и од контролната РНК (Слика 4ѓ).Овие in vitro и in vivo резултати сугерираат дека DARS-AS1 ја инхибира PACT-посредуваната PKR активација.Во исто време, забележавме и намалување на закрепнувањето на PACT во присуство на DARS-AS1 (Слика 4ѓ).Овој резултат е конзистентен со резултатите од ин витро анализата за врзување на протеини (слика 4в) и повторно ја илустрира блокирачката функција на DARS-AS1 за асоцијацијата PACT-PKR.
Ser246 и Ser287 во доменот D3 на PACT се потребни за активирање на PKR под клеточен стрес.Замената на два остатоци од серин за аланин даде мутант PACT (mutD), кој го активираше PKR во отсуство на стрес, а замената за аланин (mutA) го смени протоколот.Бидејќи ја покажавме важноста на овој домен во директна поврзаност со DARS-AS1, ги генериравме овие два PACT мутанти за да тестираме дали овие остатоци може да бидат вклучени и во интеракција со DARS-AS1.Интересно, и двата мутанти ја изгубија способноста да се врзат за DARS-AS1 (Дополнителна слика 4d), што сугерира дека комплетната структура на PACT протеинот може да биде потребна за ефикасна интеракција со DARS-AS1.
Понатаму, нашите резултати сугерираат дека инхибицијата на клеточната пролиферација индуцирана од DARS-AS1-shRNA може делумно да се обнови со прекумерно изразување на доминантен негативен PACT мутант (PACTmutA) или доминантен негативен PKR мутант (PKRmut) (Дополнителна слика 4e. e).Прекумерната експресија на доминантно-негативни PKR мутанти ја намалува фосфорилацијата на PKR индуцирана од соборувањето на DARS-AS1 како и eIF2α фосфорилацијата во клетките лишени од серум (сл. 4g).Што е уште поважно, процентот на апоптотичните клетки предизвикани од соборувањето на DARS-AS1 исто така беше намален во клетките кои прекумерно изразуваат PKRmut (сл. 4h и дополнителна слика 4g).Инхибицијата на активноста на PKR киназата, исто така, ја нарушува функцијата DARS-AS1, бидејќи резултатите покажаа дека падот на DARS-AS1 ретко предизвикува фосфорилација на PKR и eIF2α кога клетките биле третирани со PKR-специфичен C16 инхибитор (Сл. 4i и Дополнителна Сл. 4).).Земени заедно, нашите резултати сугерираат дека DARS-AS1 промовира клеточна пролиферација, барем делумно, со инхибиција на активирањето на PKR посредувано од PACT.
За понатамошно истражување на улогата на DARS-AS1 во туморигенезата, извршивме in vivo експерименти користејќи модел на ксенографт на глушец. Резултатите покажуваат дека падот на DARS-AS1 драматично го намалил растот на туморот кај глувците (p вредност < 0,0001) (сл. 5а). Резултатите покажуваат дека падот на DARS-AS1 драматично го намалил растот на туморот кај глувците (p вредност < 0,0001) (сл. 5а). Результаты показывают, што нокдаун DARS-AS1 резко снижает рост опухоли во мышей (значение p <0,0001) (рис. 5а). Резултатите покажуваат дека соборувањето на DARS-AS1 драстично го намалува растот на туморот кај глувците (p вредност < 0,0001) (Слика 5а).结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p 值< 0,0001）（图5a）结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p值<0,0001）（图5a）、 Результаты показали, што нокдаун DARS-AS1 значително го намалува розот опухоли во мышей (значение р <0,0001) (рис. 5а). Резултатите покажаа дека соборувањето на DARS-AS1 значително го намали растот на туморот кај глувците (p вредност < 0,0001) (Слика 5а).Така, во групата со нокдаун DARS-AS1, имаше значително намалување на просечниот волумен на туморот за околу 72,9% и средната маса на туморот за околу 87,8% (Слика 5б-г).Овие резултати силно сугерираат дека DARS-AS1 може значително да го промовира растот на туморот in vivo.
Ефекти на ад ДАРС-АС1 нокдаун врз колоректалната онкогенеза кај голи глувци.Прикажани се кривите на раст (а), големината на туморот (б), тежината (в) и сликите на туморот (г).Лентите за грешки претставуваат ±SEM. n = 10. ****p < 0,0001, со двостран студентски t тест. n = 10. ****p < 0,0001, со двостран студентски t тест. n = 10. ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. n = 10. ****p < 0,0001 студентски t-тест со две опашки.n = 10. ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验. ****p < 0,0001，通过双尾学生t检验. ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. ****p < 0,0001 студентски t-тест со две опашки.e Kaplan-Meier ја анализираше корелацијата помеѓу нивоата на изразување DARS-AS1 и целокупното преживување кај пациенти со UVM, KICH, KIRP, MESO, GBM и LGG.Високите нивоа на изразување на DARS-AS1 кај пациентите беа во првите 50%;ниското ниво на изразување на DARS-AS1 кај пациентите беше во долните 50%.p-вредностите беа одредени со помош на тестот за логирање.f Предложен модел во кој DARS-AS1 ја регулира патеката PACT-PKR и растот на туморот.
За подобро да го разбереме клиничкото влијание на DARS-AS1, ја испитавме корелацијата помеѓу неговото изразување и преживувањето на пациентот.Со анализа на базата на податоци TCGA, откривме дека повисоката експресија на DARS-AS1 е поврзана со увеален меланом (UVM), бубрежна хромофобија (KICH), карцином на бубрежни папиларни клетки (KIRP), мезотелиом (MESO), мултиплекс.Пониското преживување беше значително поврзано со морфоза на глиобластом (GBM) и пациенти со низок степен на мозочен глиом (LGG) (Слика 5д).Овие резултати сугерираат дека DARS-AS1 може да игра важна улога во клиничката прогресија на туморот и може да биде потенцијален предиктивен биомаркер кај повеќе видови на рак.
Во оваа студија, користејќи функционален скрининг CRISPRi од големи размери, утврдивме дека DARS-AS1 lncRNA го надминува стресот на клетките на ракот со регулирање на два клучни одговора на стрес, PACT и PKR.Со директна интеракција со PACT, DARS-AS1 го инхибира активирањето на PKR посредувано од PACT, со што спречува апоптотична клеточна смрт и промовира клеточна пролиферација (сл. 5f).Управувањето со DARS-AS1 е забележано кај повеќе типови на рак, што сугерира дека неговата функција за промовирање на преживување на клетките на ракот под стресни услови може да биде широко применлива за повеќе видови на рак.
PACT е идентификуван како PKR-активаторски протеин, а активирањето на PKR со посредство на PACT игра важна улога во одговорите на стрес преку регулирање на транскрипцијата, транслацијата, апоптозата и другите важни клеточни процеси62.Со децении се прават обиди да се разбере специфичната регулација на ракот на каскадата PACT-PKR.Овде, нашата студија откри различен механизам на регулација на PACT-PKR во клетките на ракот преку клеточната lncRNA DARS-AS1, која директно се врзува за PACT, ја блокира интеракцијата PACT-PKR, ја инхибира активацијата на PKR и фосфорилацијата eIF2α, а со тоа ја инхибира апоптозата индуцирана од стрес и стимулирање на евентуалната пролиферација на ракот.клетки.Ова откритие фрла светлина врз потенцијалните цели на lncRNA за прогноза и терапија на ракот.
Нашите податоци покажаа дека соборувањето на DARS-AS1 ги сензибилизира клетките на серумско гладување со значително зголемување на фосфорилираната PKR и eIF2α.Овие резултати сугерираат дека DARS-AS1 го промовира преживувањето на клетките на ракот под тешки услови преку инхибиција на активноста на PACT/PKR.Неколку други некодирачки РНК, како што се ASPACT и nc886, исто така се вклучени во оската PACT/PKR со намалување на регулацијата на PACT48 mRNA или регулирање на автофосфорилацијата со врзување за PKR49,50,64.Меѓу нив, DARS-AS1 делува како нарушување на асоцијацијата PACT-PKR.Оваа студија го збогатува нашето разбирање за регулацијата на оската PACT/PKR и улогата на lncRNA во одговорите на стрес.
PACT содржи три посебни домени.Секој од првите два dsRBD е доволен за да се постигне висок афинитет врзување на PACT за PKR, додека третиот домен (D3) е потребен за активирање на PKR in vitro и in vivo.Нашата студија покажа дека DARS-AS1 преференцијално комуницира со доменот D3 (сл. 3h).Со оглед на големата големина на lncRNA (768 нуклеотиди), врзувањето на DARS-AS1 за D3 може физички да ја инхибира интеракцијата помеѓу PACT доменот на dsRBD и PKR, со што ја блокира поврзаноста на PACT и PKR.Точките PACT мутации кои ги заменија Ser246 и Ser287 во D3 со аланин или аспартат го нарушија неговиот сврзувачки афинитет за DARS-AS1, што укажува на важноста на севкупните структурни и електрични својства на D3 во нивното поврзување.Во иднина ќе бидат потребни дополнителни детали за овој механизам, користејќи попрецизна биохемиска анализа и структурна анализа на PACT со висока резолуција.
Претходните студии објавија дека DARS-AS1 промовира клеточна пролиферација преку неколку механизми51,52,53.Во еден пример, истражувачите забележаа дека DARS-AS1 го регулираше неговиот антисенс протеин-кодирачки ген DARS со таргетирање на miP-194-5p во клетките на ракот на бубрезите.Меѓутоа, во тековната студија, нокдаунот на DARS-AS1 имаше мал ефект врз транскрипцијата на DARS кај повеќе типови на рак, вклучувајќи барем колоректален карцином, дојка и рак на црниот дроб.Бидејќи lncRNAs покажуваат шаблони на изразување специфични за клетките и ткивата, функционалните механизми може да не се зачуваат кај типовите на рак, што може да придонесе за ова несовпаѓање помеѓу нашите набљудувања и претходните проценки на различни видови рак.Потребни се посебни студии за да се разјаснат специфичните механизми на различни физиолошки и патолошки процеси.
Анализата на клиничките податоци покажа дека експресијата на DARS-AS1 кај туморите е во обратна корелација со преживувањето на пациентите со рак, што ја нагласува важноста на оската DARS-AS1/PACT/PKR во прогнозата на ракот.Како заклучок, нашата студија покажува дека DARS-AS1 е регулатор на сигналната оска PACT/PKR, ја промовира пролиферацијата на клетките на ракот и ја инхибира апоптозата за време на одговорот на стресот, што обезбедува друга линија на истражување и е од интерес за идни истражувања за потенцијални третмани .
Човечки клеточни линии SW620, A549, MBA-MD-231, HCT116, HepG2 и HEK293T беа добиени од Националната инфраструктура за ресурси на клеточната линија во Кина.Сите клетки беа одржувани во DMEM медиум (DMEM, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) дополнет со 10% FBS (Gemini, Brooklyn, NY) и 1% пеницилин-стрептомицин (Thermo Fisher Scientific) на 37°C, 5% CO2.инкубатор.
Anti-PACT, Abcam (ab31967);Анти-PKR, Abcam (ab184257);Анти-PKR (фосфо-Т451), Abcam (ab81303);Анти-знаме, Abcam (ab125243);Анти-eIF2α, Abcam (A0764));анти-eIF2α (фосфор S51), Abcam (ab32157);анти-PACT (фосфор S246), Abgent (AP7744b);анти-β-тубулин, CST (2128);нормален IgG на глушец, CST (5415S);нормален зајак IgG, CST (2729S).Антителата беа разредени 1:1000 во PBST за Western blotting и 1:100 за IP.
sgRNA беа развиени со користење на јавно достапна алатка наречена CRISPR-ERA66.Ги користевме стандардните параметри на алатката за развој на sgRNA и алгоритмот ги пресмета местата за врзување на sgRNA во регионот од 3 kb.центриран во TSS.Базени од sgRNA олигонуклеотиди беа синтетизирани во CustomArray, Inc. (Bothewell, WA) и клонирани во хуманизирани pgRNA плазмиди (Addgene #44248).Вкупно 12 μg здружен хуманизиран pgRNA плазмид, 7,2 мг psPAX2 (Addgene #12260) и 4,8 μg pMD2.G (Addgene #12259) беа ко-трансфектирани во 5 x 106 HEK293T во 10 cm дијагностика на трансфекција клетки (CWBIO, Пекинг, Кина) следејќи ги упатствата на производителот.Супернатантите што содржат вирус беа собрани 48 и 72 часа по трансфекцијата и филтрирани преку филтер од 0,45 µm.За скрининг, клетките SW620 кои го изразуваат фузионниот протеин dCas9/KRAB беа добиени со трансдукција на вирусот.Модифицираните SW620 клетки беа инфицирани со вирусната библиотека во четири независни експерименти со инфекција на MOI од 0,1-0,3 и беа земени примероци со 2 μg/ml пуромицин (Sigma, St. Louis, MO) за 2 дена.Потоа, клетките беа култивирани 18 дена ин витро со минимална библиотечна покриеност од 500 клетки/sgRNA за скрининг.
Геномската ДНК беше извлечена според упатствата на QIAamp DNA Blood Midi Kit (QIAGEN, Дизелдорф, Германија; 51183).Вкупно, 100 μg геномска ДНК по биолошко повторување беа искористени за изградба на библиотеката.Регионот sgRNA беше засилен со два круга на PCR и поврзан со баркод.
Производите на PCR беа прочистени со помош на NucleoSpin® гел и комплет за прочистување PCR (MACHEREY-NAGEL, Düren, Германија; 740609.250) и квантифицирани со употреба на комплет за детекција на двоверижна ДНК Qubit™ HS (Thermo Fisher Scientific; Q32854).
МТС анализата беше користена за мерење на клеточната пролиферација.Клетките беа засеани во плочи со 96 бунари со почетна густина од 2000 клетки/бунар.Релативниот број на клетки се мереше дневно во наведеното време за вкупно 4-6 дена.За секој бунар, 20 μl MTS реагенс (Promega) беше разреден со 100 μl DMEM, инкубираше со клетки 4 часа на 37 ° C, а потоа беше измерен OD490.
Капацитетот за незакотвен раст е откриен со анализа на формирањето на сфери.Накратко, 2000 клетки трансфектирани со shRNA DARS-AS1 или контролна shRNA беа култивирани во микроплочи со ултра ниска прикачување (Corning) со средна промена на секои 4 дена.Сфероидите беа избројани по 14 дена.500 клетки трансфектирани со DARS-AS1 плазмидот за прекумерна експресија или контролен плазмид беа користени за анализата за подобрување, инаку методот беше непроменет.
РНК беше транскрибирана со користење на T7 RNA полимераза и биотин-16-UTP (Roche 1138908910) според инструкциите на Riboprobe® Combination Systems (Promega P1440).Прајмерите што се користат овде се наведени во дополнителна табела 4.
PACT или PKR-кодирачките региони беа клонирани во pET15b (Addgene #73619) и трансформирани во BL21 (DE3).Бактериите беа инкубирани во текот на ноќта во LB снабдена со ампицилин и потоа разредена 100 пати со свежо LB.Кога OD600 на медиумот достигна 0,8, беше додаден 1 mM IPTG за да се индуцира протеинска експресија.По инкубација во текот на ноќта со нежно протресување (250 вртежи во минута на 20°C), клеточната пелета беше собрана со центрифугирање (4000 вртежи во минута, 10 мин, 4°C).Повторно суспендирајте го клеточниот пелети во пуфер за лиза (50 mM Tris, pH 8,0, 250 mM NaCl, 1 mM PMSF) и инкубирајте на мраз 30 мин, потоа изматете со соника (15 мин, 5 секунди вклучување/исклучување, на мраз) и центрифугирајте (13.000 вртежи во минута)., 30 мин, 4°С).Супернатантот потоа беше натоварен во Ni-NTA смола (QIAGEN) 3 пати на 4°C, измиен 4 пати со пуфер за миење (50 mM Tris, pH 8,0, 40 mM имидазол, 250 mM NaCl) и елуиран 3 пати, со вкупно од 10 ml пуфер за елуент (50 mM Tris, pH 8,0, 250 mM NaCl, 300 mM имидазол).Прочистениот протеин беше одреден со помош на WB и концентрацијата беше одредена со помош на комплетот за анализа на протеинот Qubit™ (Thermo Fisher Scientific; Q 33212).
RIP анализите беа извршени како што беше претходно опишано, со модификации.Накратко, 1x RIP пуфер (25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,5% NP-40, RNasin рибонуклеаза инхибитор (Promega), PMSF (Beyotime Biotechnology), 1 mM DDM, протеаза) lyses costatic71 xcyto (Roche, 1 mM DTT) и центрифугирајте на 13.000 вртежи во минута 15 мин на 4 °C.Супернатантот потоа беше инкубиран со протеин A+G магнетни зрна (Millipore) конјугирани со 5 μg анти-PACT антитела (Abeam) или IgG (CST).Зрната беа измиени 5 пати со 5x RIP пуфер, а потоа се вари со протеиназа К (NEB).РНК беше екстрахирана со Trizol и одредена со RT-qPCR.Прајмерите се претставени во дополнителна табела 5.
Ин витро RIP анализата беше изведена според модифициран стандарден протокол за RIP анализа.Вкупно 5 pmol од ин витро транскрибирана РНК беше разредена 1x со RIP пуфер и се вареше со инкубација на 65°C за 5 минути проследено со бавно ладење до собна температура.Вкупно 5 pmol непроменети или мутирани PACT протеини означени со знаме беа прочистени од E. coli.Инкубирајте со ренатурирана РНК 2 часа на 4°C и следете ја горенаведената процедура за RIP анализа за IP против знаме.
За анализа на екстензија на РНК, 1×107 клетки беа лизирани со 1xRIP пуфер.По центрифугирање на 13.000 вртежи во минута за 15 мин на 4°C, супернатантот беше претходно третиран со 30 μl магнетни зрна од стрептавидин (Бекман) 2 часа на 4°C.Прочистениот лизат потоа беше снабден со квасец tRNA и инкубиран со 40 pmol ренатурирана РНК во текот на ноќта на 4°C, а потоа уште 2 часа и беа додадени 20 μl нови магнетни зрна стрептавидин блокирани со BSA.Чекорот на миење се состоеше од 4 пати со 5x RIP бафер и 4 пати со 1x RIP тампон.Соодветните протеини беа елуирани со пуфер за елуција на биотин (25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 12,5 mM D-биотин, PMSF) и одвоени на NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel (Invitrogen).По боење со сребро (Beyotime Biotechnology), одредени ленти беа исечени и анализирани со MS.
Беше направена Co-IP анализа за да се тестира интеракцијата помеѓу PACT и PKR.Накратко, лизатите на супернатантот беа подготвени со инкубирање на 1 x 107 лизирани клетки во 1 x RIP пуфер проследено со центрифугирање на 13.000 вртежи во минута за 15 минути на 4 ° C.Лизатите беа наполнети со протеин A + G магнетни зрна, конјугирани со 5 μg анти-PACT антитела и нежно ротирани преку ноќ на 4°C.Монистрата беа измиени 3 пати со 5×RIP пуфер, двапати со 1×RIP пуфер и елуирани со 1×SDS пуфер.Обновениот протеин беше анализиран со SDS-PAGE гел и откриен од WB.
Два pmol означени PACT и 1 pmol PKR беа прочистени од E. coli.Разредете во 1× RIP пуфер и инкубирајте со 10 pmol ренатурирана РНК 2 часа на 4 °C.После тоа, тие беа инкубирани со протеин A+G анти-етикетирани антитела конјугирани со магнетни зрна уште два часа.Монистрата потоа беа измиени четири пати со 1x RIP пуфер и елуирана со 1x SDS пуфер.Добиените PACT и PKR беа откриени од страна на СБ.